Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neuroscience
0 visualizaciones • 3:10 min. • July 8th, 2025
Coloque una retina murina en un colador de células humedecido y macera con movimientos circulares para separar las células de la retina de la matriz extracelular.
Transfiera el colador a un tubo de recolección.
Agregue un tampón de fosfato y una solución de suero al colador para lavar y recolectar las células.
Centrifugar para asentar las células. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un tampón de fosfato y una solución de suero.
Agregue anticuerpos bloqueadores que se unen a los receptores Fc en las células, evitando la unión no específica de anticuerpos diana.
A continuación, agregue anticuerpos primarios marcados con fluorescencia y sin etiquetar que se unen a marcadores específicos de la superficie celular en varios tipos de células.
Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Agregue un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia para unirse al anticuerpo primario sin marcar.
Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Realice la clasificación de células activadas por fluorescencia, o FACS, para capturar las distintas señales fluorescentes de las células marcadas y clasificar las células ganglionares de la retina de varias poblaciones de células de la retina.
Coloque hasta 12 retinas en un colador de nailon estéril de 70 micras humedecido con PBS y FBS, y macera suavemente la retina con el extremo posterior de un émbolo de jeringa de 10 mililitros con movimientos circulares. Cuando todas las células se hayan disociado, coloque el filtro sobre un tubo de recolección de polipropileno y use una pipeta P1000 para filtrar las células a través del filtro hacia el tubo de recolección.
Enjuague el colador con PBS y FBS, acumulando el lavado en el tubo de recolección. Agregue suficiente PBS más FBS para llevar el volumen final a 1 mililitro de solución por retina y recolecte las células por centrifugación. Luego, vuelva a suspender el gránulo en PBS más FBS a una concentración de 1 mililitro de medio por 5 retinas. A continuación, bloquee cualquier unión inespecífica del receptor de FC en cada tubo con 1 microlitro de anticuerpo CD16/32 anti-ratón por 1 x 106 células durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación de bloqueo, agregue el cóctel de anticuerpos de interés a las células con un pipeteo suave para una incubación de 30 minutos en hielo protegido de la luz. Luego, lave las células dos veces en un volumen final de 4 mililitros de PBS y FBS. Etiquete las células con un anticuerpo secundario apropiado durante otros 30 minutos en hielo protegido de la luz, seguido de 2 lavados en PBS más FBS, y cargue el tubo de muestra en el citómetro de flujo.