Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neuroscience
0 visualizaciones • 2:42 min. • July 8th, 2025
Coloque una preparación neuromuscular de larvas vivas de Drosophila en una cámara de registro que contenga solución salina libre de calcio.
Las neuronas larvarias expresan un canal catiónico sensible a la luz.
Cambie a solución salina con calcio agregado que contenga un tinte fluorescente.
El colorante emite fluorescencia débilmente en el estado no internalizado, pero fuertemente cuando es internalizado por las neuronas.
Ilumina la larva con luz azul.
Esto activa el canal, induciendo la afluencia de cationes y la despolarización de las neuronas, iniciando un potencial de acción.
El potencial de acción alcanza la terminal sináptica en la unión neuromuscular, permitiendo la entrada de calcio y la exocitosis vesicular.
Posteriormente, la membrana unida al tinte se internaliza durante el reciclaje de vesículas.
Lavar con solución salina sin calcio para detener el reciclaje de vesículas y eliminar cualquier tinte no internalizado.
Visualice la señal de fluorescencia.
A continuación, introduzca solución salina sin colorantes y calcio añadido e ilumine nuevamente.
Esto induce otro potencial de acción, la entrada de calcio y la exocitosis de vesículas que contienen colorantes.
Visualiza la señal de nuevo.
La liberación de colorante debido a la exocitosis de vesículas reduce la fluorescencia en comparación con el estado durante la internalización de vesículas.
Para la estimulación de canalrodopsina, conecte un LED azul a un estimulador programable con un cable coaxial y coloque el LED en el puerto de la cámara. Enfoque el haz de luz LED azul en la preparación con tinte FM usando la función de zoom del microscopio.
El paso más crítico en este punto del procedimiento es asegurarse de que la configuración del LED se mantenga constante y que ilumine la misma parte de cada animal para todas las condiciones que se comparan para garantizar una fuerza de estimulación constante.
Inicie la estimulación de luz y realice un seguimiento con el temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética. Cuando el temporizador se detenga, retire rápidamente la solución de colorante FM y reemplácela con solución salina sin calcio para detener el ciclo SV. Para la descarga del tinte FM, inicie la estimulación de la luz y realice un seguimiento con el temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética. Cuando finalice el período del temporizador, retire rápidamente la solución de colorante FM y reemplácela con solución salina sin calcio para detener el ciclo de SV.