Obtención de suspensiones celulares a partir de tejidos cerebrales de ratón isquémico

Tome tejidos cerebrales isquémicos de ratón perfundidos que contengan células cerebrales y células inmunitarias infiltradas.

Pica los pañuelos en un colador y enjuaga con tampón.

Centrifugar el filtrado y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el gránulo en una solución de enzimas digestivas y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga.

Incubar para que las enzimas digestivas descompongan la matriz extracelular, aflojando las células.

Filtre la suspensión y enjuague con un tampón que contenga ADNasa para eliminar el ADN contaminante.

A continuación, lave con tampón sin DNasa.

Centrifugar el filtrado y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender las celdas en el medio de gradiente de densidad. Luego, transfiera el contenido a un tubo nuevo y mezcle. Centrífuga para separar los componentes por densidad.

Retire el sobrenadante que contiene mielina y desechos.

Vuelva a suspender el gránulo en tampón libre de ADNasa. Transfiéralo a un tubo nuevo y centrifugue nuevamente.

Deseche el sobrenadante para asegurar una eliminación suficiente del medio de gradiente de densidad.

Finalmente, vuelva a suspender las celdas en el búfer para un análisis más detallado.

Usando el extremo del émbolo de una jeringa de 5 mililitros, triture los trozos de tejido cerebral a través de un colador de células de 100 micrones, enjuagando continuamente el colador con HBSS helado con calcio y magnesio. Luego coloque los tejidos homogeneizados en hielo.

Cuando se hayan procesado todas las muestras, reduzca las suspensiones celulares. Y deseche con cuidado los sobrenadantes. Vuelva a suspender los gránulos en 1 mililitro de tampón de digestión. Luego transfiera la suspensión celular a un tubo de 2 mililitros.

E incubar las células bajo rotación lenta y continua a 37 grados centígrados. Después de una hora, tamizar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micras. Y enjuague bien el filtro con 3 mililitros de tampón de lavado que contenga DNasa. Luego lave el colador con 15 mililitros de tampón de lavado sin DNasa. Gire las celdas hacia abajo y deseche el sobrenadante.

Para eliminar los restos celulares y la mielina, vuelva a suspender las células en 5 mililitros de medio de gradiente de densidad al 25% a temperatura ambiente y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Mezcle bien las células y el gradiente con un pipeteo suave repetido. Luego gire la solución celular.

Al final de la separación, aspire con cuidado la capa de mielina y el sobrenadante sin alterar el gránulo. Y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de tampón de lavado sin DNasa. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y gírelas hacia abajo nuevamente, resuspendiendo el gránulo en 100 microlitros de tampón de lavado en frío.