Name: El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende a aislar exosomas de bilis humana mediante ERCP para perfilar microRNA. Este método robusto permite identificar biomarcadores de enfermedades biliares como colangiocarcinomas.

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Este estudio fue respaldado por un Premio K08 (DK090154-01) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH; a F.M.S.).

La obtención de la bilis de pacientes por la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) requiere la aprobación de un protocolo de estudio los sujetos humanos por la Junta de Revisión Institucional. Todo el trabajo que aquí se presenta ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins. 1. Aislamiento de exosomas de la bilis <ol><li> Realizar la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE). Colocar al paciente en posición supina y intubar. <ol><li> Pasar un duodenoscopio a través de la boca del paciente y la inserta en la segunda parte del duodeno e identificar la papila mayor. </li><li> Selectivamente canular el conducto biliar común mediante la inserción de un triple lumen esfinterotomo pre-cargado con una guía hidrofílica 0,035 pulgadas (0,9 mm). </li><li> Avanzar la guía bajo guía fluoroscópica con el conducto hepático izquierdo ya que en ocasiones puede ser difícil diferenciar el conducto cístico desde el conducto hepático derecho, a continuación, hacer avanzar elesfinterótomo 5 cm en el conducto biliar para adquirir una posición estable. </li><li> Retire el alambre guía, acople una jeringa de 10 ml al puerto de alambre guía a través del cierre Luer y aspirar la bilis utilizando 10 ml de presión negativa. </li><li> Retire la jeringa que contiene la bilis para proceder con la CPRE volviendo a insertar el alambre de guía y el agente de contraste a través de la inyección de la abertura de inyección para opacificar el árbol biliar. </li><li> La transferencia de la bilis recogido en un tubo de 15 ml en hielo y mantener en hielo hasta que esté listo para proceder con la etapa de centrifugación. Precaución: Use guantes para protegerse y proteger a las muestras! El tratamiento de la bilis como una fuente potencial de infección, ya que puede contener partículas virales de hepatitis A! </li><li> Mantenga la muestra (s) en hielo. Cualquiera de proceder con el paso 1.2 o centrifugar a 500 xg a 4 ° C durante 10 min y luego se congelan a -80 ° C hasta su uso posterior. Nota: Las muestras almacenadas de esta manera durante varios años de forma rutinaria se han utilizado con buenos resultados 19. </li></ol&gt; </li><li> Transferencia de 400 l de bilis en un tubo de microcentrífuga y recoger las células y los restos celulares por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante con la pipeta, transferir a un tubo de microcentrífuga fresco y centrifugar la muestra (s) a 16.500 xg durante otros 20 min a 4 ° C para borrar el sobrenadante de desechos adicionales. Desechar los tubos en los residuos de riesgo biológico. Como alternativa, girar las muestras en una ultracentrífuga lugar. </li><li> Recoger el sobrenadante y filtrar en una cabina de bioseguridad con una jeringa a través de un filtro de membrana de 0,2 micras de polietersulfona (PES) que tiene buenas tasas de flujo y baja en proteínas de unión para eliminar las partículas más grandes que 200 nm fue. </li><li> Pipetear el sobrenadante se filtró para ultracentrífuga tubos y añadir PBS de modo que los tubos son más de 2/3. Si los tubos contienen menos líquidos que eso, los tubos se derrumbará durante la centrifugación! Los tubos pueden ser lavados, en autoclave y volver a utilizar varias veces. </li><li> Pelly los exosomas mediante ultracentrifugación a 120.000 xg durante 70 min a 4 ° C. Después de la centrifugación mirada en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga para ver a veces pequeñas bolitas amarillas; estos son los exosomas. </li><li> Eliminar el sobrenadante por decantación con cuidado y desinfectar los residuos mediante la adición de cloro para una concentración final de 10% v / v y se deja reposar durante 20 minutos. </li><li> Para los experimentos de aguas abajo, o bien procesar la pastilla (s) en un pequeño volumen de la solución apropiada (es decir, ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón para el aislamiento de proteínas, tampón de lisis de ARN para el aislamiento MIR) o resuspender en 50 a 150 l de fosfato tamponada de solución salina (PBS) que puede ser almacenado, ya sea a -80 ° C para su uso futuro (reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) o la extracción de proteínas etc.) o se utiliza para la caracterización de la preparación exosome por TEM o análisis óptico de nanopartículas . </li></ol> 2. Identificación por exosomeMicroscopía Electrónica de Transmisión (TEM) o cryoEM <ol><li> Volver a suspender las vesículas extracelulares en 100 l de PBS con la pipeta. Lo ideal es utilizar exosomas que no han sido almacenadas a -20 ° C o -80 ° C, especialmente cuando se realiza el aislamiento por primera vez. </li><li> Adsorber una alícuota de 20 l (aproximadamente 2 g) a 400 rejillas de cobre Parlodion recubiertas de carbono de malla durante 2 minutos y dejar secar a temperatura ambiente. </li><li> Fijar el exosoma en 1% (v / v) de glutaraldehído (EM-grado) durante 5 min a RT mediante la colocación de gotas cuidadosamente sobre la preparación seca. </li><li> Lavar las rejillas dos veces con agua durante 5 min y luego contrastar EVs mancha con ácido fosfotúngstico al 1% (PTA) durante 30 s. </li><li> Adquirir imágenes con un microscopio electrónico con un voltaje de aceleración de 80 kilovoltios a partir de las ampliaciones de 20.000X y se eleva a 100,000X al determinar el tamaño de las partículas. Nota: Otras preparaciones como capas en 200 rejillas de malla de carbono recubiertos con Formvar de cobre o níquel y li contraste tinciónke 1% o 2% de acetato de uranilo durante 10-15 min también son posibles. </li><li> Para cryoEM, mezclar una parte alícuota de 20 l (aproximadamente 2 g) con 60 l de proteína G de oro 10 nm (relación 1: 3). Esto ayudará a determinar el diámetro de exosomas. </li><li> La transferencia de las muestras sobre rejillas de carbón perforado descargada resplandor-C-plana y eliminar el exceso de líquido mediante secado. Congelar las rejillas sumergiéndolos inmediatamente en etano líquido. </li><li> Montar las rejillas en un cryoholder en nitrógeno líquido. </li><li> Adquirir las imágenes en 200 kV con magnificaciones de 20.000X y 100,000X. </li></ol> 3. Identificación por exosome multiparámetros de nanopartículas análisis óptico <ol><li> Volver a suspender los exosomas aislados en 100 l de PBS con la pipeta. </li><li> Diluir exosomas en 600 l de PBS en varias proporciones diferentes (como 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 y 1: 1200). </li><li> Visualizar los exosomas por dispersión de luz láser con el instrumento y el software adecuado en tiempo real de acuerdo con la fabriel protocolo del RER 20. </li><li> Aumentar el nivel de la cámara en el modo de captura hasta que las partículas se hacen visibles, a continuación, ajustar el enfoque para hacer que las partículas se vean sin problemas. </li><li> Mientras que en el modo estándar, disminuir la cámara al nivel más bajo que las partículas todavía pueden verse, si es necesario ajustar obturador de la cámara y la ganancia para lograr esto. </li><li> una inspección visual para asegurarse de 20-100 partículas son visibles en la pantalla, si no eliminar la unidad y ajustar la dilución en PBS. </li><li> A continuación, ajuste la duración de captura de entre 30-60 seg. Después de que se capturó el vídeo, ajustar los parámetros de proceso hasta que todas las partículas se clasifican en la pantalla y procesar el archivo de vídeo. </li></ol> 4. Caracterización de exosomas por Western Blot <ol><li> Lyse gránulos de exosoma de 2-5 ml de bilis en 100 l de ensayo de radioinmunoprecipitación enfriado con hielo (RIPA) tampón con un inhibidor de la proteasa pipeteando arriba y abajo a fondo y mezclar lisados ​​vigorosamente durante 30 secen un vórtice para solubilizar las proteínas de manera eficaz. </li><li> Mientras que la mayoría de las veces no es necesario, utilizar pulsos de sonicación de las muestras en hielo con 2 impulsos de 10 segundos cada uno para asegurar la lisis completa. </li><li> Se precipitan material insoluble por centrifugación a 15.000 xg a 4 ° C durante 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo limpio. </li><li> Determinar la concentración de proteína con un método de elección (es decir, el ácido bicinconínico (BCA), Coomassie, Lowry modificado, 660 nm de ensayo de proteínas, etc.) según el protocolo del fabricante. El método no es tan importante como el tiempo que se utiliza el mismo método consistente para lograr los resultados que se pueden comparar a través de experimentos. </li><li> Cargar 50 g de proteína por muestra en tampón de Laemmli después de calentar la muestra a 95 ° C durante 5 min en un pozo de un gel de poliacrilamida para electroforesis (PAGE). </li><li> La electroforesis de las muestras en los geles PAGE durante 1,5 horas y transferir las proteínas separadas a una membrana de nylon. </li><li> segundobloquear la membrana (s) con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween 20 (TBS-T) durante 1 h, después se incuba con anticuerpos de exosoma específica como anti-CD63 y anti-TSG-101 a una dilución de 1: 500, preferiblemente O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar las membranas con TBS-T 3 x 10 min, a continuación se incuba con un apropiado, búsqueda de anticuerpo secundario conjugado con HRP en 5% de leche sin grasa en TBS-T durante 1-2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la membrana (s) 3 x 5 min con TBS-T y detectar las proteínas específicas con reactivos de quimioluminiscencia de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Image las membranas con película o un sistema de imagen digital de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol> 5. El microARN aislamiento de los exosomas aislados Nota: El aislamiento de los genes miARN de exosomas biliares se lleva a cabo utilizando un aislamiento de los genes miARN modificado basado en un kit disponible en el mercado, pero cualquier otro método de aislamiento de ARN puede utilizarse o adaptarse. <ol><li> Añadir 300 y# 181; l tampón de lisis / edificio al sedimento de exosomas (aislado de la bilis 400 l), vórtice, pipeta o pasar a través de una aguja / jeringa para lisar completamente los exosomas para obtener un lisado homogénea. </li><li> Añadir 1/10 (30 l) volumen de miARN homogeneizado aditivo, y mezclar bien por agitación o invirtiendo el tubo varias veces. </li><li> Incubar la mezcla durante 10 min en hielo. </li><li> Añadir un volumen de ácido-fenol: cloroformo igual al homogeneizado inicial (300 l). </li><li> Añadir 5 l de 5 fmol / l cel-MIR 39 y agitar durante 30-60 segundos. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg a la temperatura ambiente para separar la fase acuosa (superior) y las fases orgánicas (inferiores). </li><li> aspirar con cuidado la fase superior con la pipeta y transferir a un tubo nuevo al tiempo que observa el volumen transferido. Descartar la fase orgánica en el contenedor de residuos orgánico apropiado. </li><li> Para enriquecer a los pequeños ARN añaden 1/3 volumen de etanol al 100% a la fase acuosa recuperada y mezclar mediante agitación o invirtiendo muchísimo de la maser varias veces. </li><li> Pipetear la mezcla de lisado / etanol en el cartucho de filtro, hasta 700 l a la vez. </li><li> Centrifugar los cartuchos de 15 segundos a un máximo de 10.000 xg o aplicar vacío para pasar la mezcla a través del filtro. </li><li> Recoger el filtrado y si la mezcla de lisado / etanol es superior a 700 l, transferir el flujo a través de un tubo nuevo y repita el procedimiento para recoger todos los filtrados. Estos filtro contiene fracciones de ARN desprovistos de ARN pequeños y se puede utilizar para recuperar estos ARN de mayor tamaño. </li><li> Añadir 2/3 volumen de RT 100% de etanol al filtrado total y mezclar bien con un vórtex. </li><li> Pipetear la mezcla de filtrado / etanol en un segundo cartucho de filtro. Al igual que antes de que el volumen máximo que se puede aplicar a la vez es de 700 microlitros. </li><li> Centrifugar durante 15 segundos a 10.000 xg o aplicar vacío como se describe en el paso 5.10. </li><li> Desechar el flujo continuo, y repetir hasta que todos mezcla de filtrado / etanol ha sido filtrada. </li><li> aplicar 70081; l miARN solución de lavado 1 al cartucho de filtro, se centrifuga durante 5-10 segundos o aplicar vacío y deseche el flujo continuo. </li><li> Lavar el filtro con 500 l de solución de lavado 2/3 como se hizo en el paso 5.16. </li><li> Repetir el lavado por segunda vez con 500 l de solución de lavado como en el paso 2/3 5.16, desechar el flujo a través y colocar el filtro en el tubo de recogida. </li><li> Girar el cartucho de filtro durante 1 min a 10.000 xg para eliminar todo el fluido residual desde el filtro. </li><li> Transferir el cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco y aplicar 100 l de agua libre (95 ° C) nucleasa caliente para el centro del filtro. </li><li> Girar los montajes de 20-30 segundos a la máxima velocidad para recuperar el ARN. </li><li> Recoger el eluido y utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li>
<li>Aushev, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+microRNA+patterns+in+plasma+before+and+after+tumor+removal+reveal+new+biomarkers+of+lung+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma.</a> PLoS One. 8 (10), e78649(2013).</li>
<li>Ben-Dov, I. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+microRNA+as+potential+biomarkers+of+autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+progression%3A+description+of+miRNA+profiles+at+baseline%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline.</a> PLoS One. 9 (1), e86856(2014).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+and+intercellular+transfer+of+microRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells.</a> J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat. Commun. 2, 282(2011).</li>
<li>Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+miRNAs+exploiting+the+endosomal-exosomal+pathway+for+intercellular+cross-talk+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Bessho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+candidate+microRNAs+for+pathogenesis+of+experimental+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia.</a> BMC Syst. Biol. 7, (2013).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+microRNA+profile+distinguishes+cholangiocarcinoma+from+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+recognition+assay+reveals+prostasomes+as+promising+plasma+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer.</a> Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bile+contains+microRNA-laden+extracellular+vesicles+that+can+be+used+for+cholangiocarcinoma+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis.</a> Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).</li>
<li>Gabriel, D. A., Giordano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle+sizing+and+counting+using+light+scattering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Microparticle sizing and counting using light scattering methods.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene intereses financieros contrapuestos.

Para utilizar de forma fiable exosomas aisladas de la bilis, es importante emplear los métodos de aislamiento de alta calidad consistentes para obtener muestras de alta calidad a cambio. La metodología definida en este trabajo es una manera bien establecida para aislar los exosomas y miARN de la bilis humana. En él se destacan varios pasos cruciales en la caracterización de los exosomas aisladas que como mínimo deberían formar parte de microscopía electrónica de análisis óptico o de nanopartículas y transferencias de We...

Al igual que otros fluidos biológicos, es decir, la leche materna, plasma u orina, bilis contiene lípidos exosomas, vesículas ricas 1-4. Los exosomas pueden inducir o alterar las funciones biológicas en células receptoras 5, 6, una forma de comunicación célula-célula que podría ser parte de su función normal 4, 7-9. Los exosomas pueden contener especies miARN que pueden proporcionar una valiosa fuente de biomarcadores para el diagnóstico 10. perfiles de miRNAs han ganado considerable atención en los últimos años como marcadores de diagnóstico y pronóstico para una variedad de enfermedades 11-14. sí miARN puede encontrarse en fluidos biológicos, posiblemente liberada por las células muertas y la cantidad de células que se desprenden pueden ser influenciados en gran medida por una enfermedad subyacente. El perfil de miARN de exosomas no refleja necesariamente el perfil de miRNA de las células originarias 6, 10, 15-17, sin embargo, puede llevar a exosomas firmas de miARN que podrían ser característico de la CE de los padreste gusta una célula tumoral. Exosomas derivado de un tumor se han identificado en el plasma de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, cáncer de próstata y otros tumores 8, 16, 18. El objetivo de este método es el aislamiento fiable y robusto de exosomas de muestras biliares humanos, en gran parte independientes de sus procedimientos de manipulación anteriores. Fue desarrollado para utilizar bilis como una fuente fiable de miARN para el diagnóstico potencial de las enfermedades de las vías biliares tales como colangiocarcinoma 19. Consta de varias etapas de centrifugación con el aumento de las velocidades de aislar exosomas y podría ser aplicable a otros fluidos biológicos.

<table><tbody><tr><td>0,2 y micro; m Filtro de membrana de polietersulfona (PES)</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>tubos ultracentrífugos de polialómero de pared delgada&nbsp;</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&nbsp;</td><td>Software de</td> análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) Nanosight<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor completo de la proteasa</td><td>Roche distribuido por Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD63</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microrna

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

exosome la investigación en los últimos tres años ha ampliado considerablemente el alcance hacia la identificación y caracterización de biomarcadores y sus usos terapéuticos. Los exosomas han sido recientemente demostrado que contienen microRNAs (MIR). MIRS mismos han surgido como biomarcadores valiosos para fines de diagnóstico. Como la recogida de muestras en clínicas y hospitales es bastante variable, miARN aislamiento de la bilis toda varía sustancialmente. Para lograr perfiles de miARN robustos, precisos y reproducibles de muestras de bilis recogidos de una manera sencilla requerido el desarrollo de un protocolo de alta calidad para aislar y caracterizar los exosomas de la bilis. El método requiere varias centrifugaciones y una etapa de filtración con una etapa de ultracentrifugación final para sedimentar las exosomas aisladas. La microscopía electrónica, transferencias Western, citometría de flujo y análisis óptico de nanopartículas de múltiples parámetros, si están disponibles, son pasos cruciales para validar la caracterización de la calidad del correoxosomes. Para el aislamiento de los genes miARN de estos exosomas, Rematar el lisado con una, miRNA sintético no específica de una especie como Caenorhabditis elegans, es decir, Cel-miR-39, es importante para la normalización de la eficacia de la extracción de ARN. El aislamiento de exosomas del líquido biliar siguiendo este método permite que el éxito miARN perfiles de las muestras de bilis acumulada durante varios años a -80 ° C.

Desde exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por microscopía regular o citometría de flujo, microscopía electrónica o análisis óptico de nanopartículas tiene que ser realizada. El análisis óptico de nanopartículas tiene la ventaja sobre la microscopía electrónica que también es cuantitativa y proporciona distribución de tamaño y la concentración. El instrumento presenta un haz de láser finamente enfocada a través de un prisma de cristal en la muestra. El movimiento browniano...

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

El objetivo general de este método es aislar exosomas de bilis humana para realizar análisis posteriores, incluyendo el perfilado de microARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades hepáticas, como la detección de un marcador biliar específico para colangiocarcinomas u otras enfermedades biliares. La principal ventaja de esta técnica es que es robusta y repetible.Para realizar una colangiopancreatografía retrógrada endoscópica, o CPRE, comience colocando al paciente en posición supina. Después de la intubación y de pasar un duodenoscopio a través de la boca del paciente, insértelo en la segunda porción del duodeno e identifique la papila mayor. Canule selectivamente el conducto biliar común insertando un esfinterotomo de triple luz precargado con un alambre guía hidrófilo de 0,35 pulgadas o de 0,9 milímetros.Bajo guía fluoroscópica, avance el alambre guía hasta el conducto hepático izquierdo y luego avance el esfinterotomo cinco centímetros dentro del conducto biliar para obtener una posición estable. Tras retirar el alambre guía, conecte una jeringa de 10 mililitros al puerto del alambre guía a través del cierre inferior y utilice 10 mililitros de presión negativa para aspirar la bilis. Retire la jeringa que contiene la bilis y, tras volver a insertar el alambre guía, inyecte agente de contraste a través del puerto de inyección para opacificar el árbol biliar.Luego, transfiera la bilis recolectada a un tubo de 15 mililitros sobre hielo y, si se va a almacenar para un momento posterior, centrifugue la muestra a 500 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos antes de congelarla a menos 80 grados Celsius. Para proceder inmediatamente con el aislamiento de exosomas, transfiera 400 microlitros de bilis a un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 300 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para recolectar las células y los restos celulares. Para eliminar aún más el sobrenadante, transfiera la solución a tubos de microcentrífuga nuevos y centrifugue las muestras a 16.500 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.Luego, en una cabina de seguridad biológica, recolecte el sobrenadante en una jeringa y filtre a través de un filtro de membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier partícula restante mayor de 200 nanómetros. Transfiera el sobrenadante filtrado a tubos para ultracentrífuga y use PBS para llenar los tubos hasta al menos dos tercios de su capacidad, con el fin de evitar que los tubos colapsen durante la centrifugación. Pelote los exosomas mediante ultracentrifugación a 120.000 × g y cuatro grados Celsius durante 70 minutos.Un pequeño pellet amarillo contendrá los exosomas. Deseche el sobrenadante decantando cuidadosamente y desinfecte el residuo agregando hipoclorito de sodio hasta una concentración final del 10% volumen por volumen. Luego, déjelo reposar durante 20 minutos.Para experimentos posteriores, procese los pellet en un pequeño volumen de solución adecuada o resuspenda en 50 a 100 microlitros de PBS y almacene a menos 80 grados Celsius para uso futuro. Después de preparar las rejillas con vesículas extracelulares teñidas para contraste, o EVs, según el protocolo descrito, adquiera imágenes con un microscopio electrónico utilizando un voltaje de aceleración de 80 kilovoltios, comenzando con aumentos de 20.000 X y aumentando hasta 100.000 X, al determinar el tamaño de las partículas. Los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados mediante microscopía convencional o citometría de flujo; sin embargo, esta figura muestra los resultados de un análisis típico de seguimiento de nanopartículas, o NTA, de exosomas que mide la concentración y distribución de tamaño, que en promedio fue de 97 nanómetros en esta muestra de bilis humana aislada.La microscopía electrónica también puede utilizarse para confirmar el tamaño de las partículas aisladas en la bilis humana y esta figura muestra un resultado típico de microscopía electrónica de transmisión. Estos blottes occidentales se ensayaron para detectar proteínas enriquecidas en exosomas, como la tetraspanina CD63 y Tsg101. Este gráfico de amplificación en tiempo real muestra una variedad de especies de microARN extraídas de exosomas de bilis humana.Dado que los exosomas carecen de estándares confiables como el ARN ribosómico 18S o 28S o genes de referencia, la adición de un microARN sintético es importante para la normalización. La técnica de aislamiento de exosomas puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener y procesar bilis de pacientes o animales para aislar y analizar vesículas extracelulares.Al repetir este procedimiento, es importante recordar centrifugar la muestra a 500 G y cuatro grados antes de congelarla a menos 80, si no se puede continuar con la ultracentrifugación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como estudios de microARN, para responder preguntas adicionales, como los perfiles de microARN. No olvide que trabajar con bilis puede ser extremadamente peligroso, ya que podría contener hepatitis, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y gafas de seguridad, al realizar este procedimiento.Tras su desarrollo, la técnica allanó el camino para la investigación en el campo del colangiocarcinoma, al explorar las vesículas extracelulares como posibles biomarcadores en la bilis de pacientes con problemas biliares, como la obstrucción del PSA.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.

Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios

Este protocolo describe un método para la extracción de ARN pequeños a partir de suero humano. Hemos utilizado este método para aislar los microARNs de suero de cáncer para su uso en arrays de ADN y PCR cuantitativa singleplex. El protocolo utiliza fenol y tiocianato de guanidina reactivos con modificaciones para producir ARN de alta calidad.

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

Se describen técnicas que describen un procedimiento de gradiente para separar exosomas de partículas del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Este procedimiento se utilizó para aislar exosomas de partículas de VIH en plasma humano de individuos infectados por el VIH. Los exosomas aislados se analizaron para determinar el contenido de citocinas/quimiocinas.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Este protocolo describe la factibilidad de realizar perfiles de miRNAs en exosomas, liberados en plasma de pacientes con NSCLC, a través de un kit comercial de aislamiento de exosomas con tratamientos de proteinasa K y RNAsa, con el fin de evitar la contaminación circulante de miRNAs y evaluar sus características de biomarcadores en NSCLC.

Análisis miARN exosomal en células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) de plasma de los pacientes a través de qPCR: una herramienta de biopsia líquida factible

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Este protocolo describe el aislamiento y la cuantificación de pequeños ARN de lipoproteínas de alta densidad.

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

Las vesículas extracelulares presentes en la sangre han sido sugeridas como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades. En este trabajo se presenta un protocolo para el aislamiento de grandes microvesículas derivadas de membrana plasmática a partir de muestras de sangre periférica y su posterior análisis mediante citometría de flujo convencional y Western Blotting.

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

Aquí, presentamos un protocolo para purificar exosomas de plasma y suero con menor Co purificación de proteínas de la sangre no exosomal. El protocolo optimizado incluye tratamiento con proteasas y ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Mayor purificación de exosomas beneficios aguas abajo los análisis, incluyendo la cuantificación más exacta de las vesículas y caracterización proteómica.

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Este protocolo muestra cómo purificar microRNAs extracelulares de medios de cultivo celular para la construcción de biblioteca de RNA pequeño y secuencia de la generación siguiente. Varios puestos de control de calidad se describen para permitir a los lectores a entender qué esperar cuando trabajan con baja entradas muestras como exRNAs.

Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas

Un exosomas es una nueva generación de compañías de entrega de drogas. Hemos establecido un protocolo de aislamiento de exosomas con alto rendimiento y pureza para entrega de siRNA. También había encapsulado con fluorescencia inespecífica siRNA en exosomas y había investigado la absorción celular de exosomas cargado de siRNA en las células cancerosas.

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Aprende a aislar exosomas de bilis humana mediante ERCP para perfilar microRNA. Este método robusto permite identificar biomarcadores de enfermedades biliares como colangiocarcinomas.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

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