Name: Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a identificar proteínas de unión a ARN en células vivas mediante fotoreticulación UV y espectrometría de masa. Este método permite mapear regiones de unión sin necesidad de purificación previa.

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R.B. fue apoyado por el programa de eruditos de Searle, la Fundación de Smith W.W. (C1404) y la March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconoce apoyo de NIH concede R01GM110174 y R01AI118891 de NIH, así como DOD conceder BC123187P1. R.W.-T. fue apoyado por la beca de formación de NIH T32GM008216.

1. cultura y ampliación de troncales Nota: las células madre embrionarias del ratón son fáciles de cultura y puede ampliarse rápidamente a los números grandes requeridos experimentos bioquímicos gracias a su rápido tiempo de ciclismo. Troncales saludables doble cada 12 h.
<ol><li>Expandir troncales para el número deseado de placas gelatinizadas en mESC medio (véase abajo) en una incubadora de cultivo de tejidos se mantiene a 37 ° C, 5% CO 2, y &#62; humedad de 95%. 
	Nota: Suficiente placas deberían estar preparadas para 3-5 repeticiones biológicas para la + 4SU muestra y control - 4SU. Una placa de 10 cm (es decir, 5 millones de células) es más que suficiente para cada repetición biológica.</li>
	<li>El medio para troncales se compone de Dulbecco &#39; s modificado Eagle &#39; medio s (DMEM) suplementado con 15% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 0,5 x 1 x no esenciales aminoácidos, penicilina/estreptomicina, 100 μm beta-mercaptoetanol, 1.000 U / ml factor inhibidor de leucemia (LIF), μm 3 CHIR99021, 1 μm PD0325901.</li>
	<li>Antes pases troncales, prepare el número de placas de 10 cm.
	<ol><li>Añadir 4 mL de 0.1% de gelatina en agua, asegurándose de que se cubre toda la superficie de la placa; incubar 10 min a temperatura ambiente (RT); retirar gelatina solución.</li>
	</ol></li> <li>Células de paso al llegar a 10 millones de células por placa, típicamente ~ 48 h después de la inoculación. 
	Nota: Como troncales crecen en colonias densas, las placas nunca debe llegar a confluencia 100% como observado en líneas celulares que crecen en monocapas (e.g. HEK293 o las células 3T3). Una placa mESC debe ser pasada al ~ 50% confluente y definitivamente antes del medio se vuelve amarillo.
	<ol><li>Para separar las células, lavar las placas con cultivos densos mESC una vez en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS) suplementada con 2 mM EDTA, añada 0.05% tripsina disuelto en DMEM y devolver plancha a incubadora durante 5 minutos (37 ° C, 5% CO 2, y &#62; 95% humedad).</li>
		<li>Extraiga la placa de la incubadora y resuspender las células con un volumen igual de DMEM mediante pipeteo arriba y abajo con fuerza varias veces.</li>
		<li>Contar las células mediante hemocitómetro y asegurarse de que las células forman una suspensión unicelular (es decir, no hay racimos), luego centrifugar células mezcla 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1-2 mL DMEM.</li>
		<li>Inocular células a una densidad de 10.000 células/cm 2 en medio de la mESC (es decir, ~ 800.000 células por placa de 10 cm) mediante las placas recubiertas de gelatina preparadas en el paso 1.3.1.</li>
	</ol></li></ol> 2. La reticulación de proteínas &#8211; interacciones ARN en las células en vivo Nota: ARN-proteína reticulación está mediada por la foto-activatable ribonucleósido análogo 4-thiouridine (4SU). 4SU tiene un largo máximo de absorbancia que endógeno nucleótidos y sólo puede ser incorporado en el RNA; por lo tanto UVB de longitud de onda intermedia permite selectivamente reticulación RNA a las proteínas 25 , 26. Tratamiento UVB de células tratadas con 4SU conduce a reticulaciones covalentes entre 4SU que contiene ARN y aminoácidos, con una preferencia divulgada por Tyr, Trp, Lys, Met y Cys 27.
<ol><li>Troncales de expandir al número requerido de placas de 10 cm como se describe en el paso 1. 
	Nota: Suficiente placas deberían estar preparadas para 3-5 repeticiones biológicas para la + 4SU muestra y control - 4SU. Una placa de 10 cm (es decir, 5 millones de células) es suficiente para cada repetición biológica.</li>
	<li>Antes de que las placas alcanzan confluencia, añadir 4SU directamente en medio a una concentración final de 500 μm. deja - 4SU platos de control sin tratamiento.</li>
	<li>Placas de agitar suavemente para distribuir el 4SU homogéneo en todo el medio. Volver a la misma incubadora de cultivo de tejidos para 2 h (37 ° C, 5% CO 2, y &#62; 95% de humedad).</li>
	<li>Transferencia de placas a un cubo de hielo y deseche el medio.</li>
	<li>Lavar la placa con 5 mL de PBS helado. 
	Nota: Enjuague suavemente o podrían separar células.</li>
	<li>Añadir 2 mL de helado placas PBS y lugar sin las tapas en un crosslinker equipado con lámparas de emisión de UVB (312 nm). Irradian las placas en una configuración de energía de 1 J/cm 2. 
	Nota: Es crítico que se quitan las tapas plásticas o podrían proteger las células de la luz UV y evitar la reticulación.</li>
	<li>Recoger las células mediante elevadores celular y traslado a PBS helado en tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min, 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL PBS helada con 2 mM EDTA y 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).</li>
	<li>Cuenta las células usando un hemocitómetro. Esperar 5-10 y 10 millones de células de las placas de 10 cm y 15 cm respectivamente.</li>
	<li>Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min, 4 ° C. 
	Nota: Concentrados de células pueden utilizarse inmediatamente para el paso 3 o pueden ser flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.</li>
</ol> 3. Aislamiento de núcleos Nota: los núcleos son aislados para eliminar proteínas citoplasmáticas y aumentar la cobertura de las proteínas nucleares. Este paso puede ser reemplazado con otras formas de fraccionamiento celular para el estudio de prácticas comerciales restrictivas en compartimentos celulares diferentes.
<ol><li>Preparar helado Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.9, de 4 ° C, 1,5 mM de MgCl 2, 10 m m KCl). Use por lo menos 2,5 mL por 10 millones de células (como cuentan en el paso 2.9) para la extracción de. 
	Nota: Existencias de búfer A (por ejemplo, una botella de 500 mL) se pueden preparar con antelación y almacenar a 4 ° C por 6 meses.
	<ol><li>Antes de usar Añadir 0,5 mM Ditiotreitol (DTT) y 0,2 mM PMSF para la cantidad deseada (2,5 mL por 10 millones de células) de búfer helada A.</li>
	</ol></li> <li>Lavar las células con 2 mL de Buffer A por 10 millones de células. Vuelta a 2.500 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Descartar sobrenadante, agregar Buffer suplementado con 0.2% de un detergente no iónico, no desnaturalizantes, como el octil-fenoxi-polyethoxy-etanol A 500 μl (ver la Tabla de materiales), por 10 millones de células. Gira por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 2.500 x g durante 5 min.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, el sedimento compone de núcleos intactos sin citoplasma. 
	Nota: Los núcleos pueden utilizar inmediatamente para el paso 4 o flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.</li>
</ol> 4. Lisis de núcleos Nota: reticulado núcleos son lisis en un búfer de espectrometría de masa-compatible para liberar las proteínas y complejos ARN-proteína.
<ol><li>Añadir el tampón de lisis (9 M de urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, de 24 ° C), 200 μL por 10 millones de células. Someter a ultrasonidos para distorsionar la cromatina con un 1/8 &#34; sonda en ajuste de amplitud del 50% para el 5-10 s.</li>
	<li>Vuelta a 12.000 x g durante 5 minutos y cobrar 175 μl de sobrenadante para evitar que los pellets de. 
	Nota: 100 μl se utilizará para los próximos pasos de RBR-ID y el restante 75 μl de lisado puede ser almacenado a-80 ° C para uso posterior o mancha blanca /negra occidental análisis.</li>
	<li>Concentración de la proteína medida mediante el ensayo de Bradford o similar técnica 28. Diluir la concentración de proteína en las diferentes muestras a 1 mg/mL o la concentración más baja de la muestra utilizando cantidades adecuadas de tampón de lisis. 
	Nota: De los núcleos de troncales 10 millones cuentan con 100-200 μg de proteína.</li>
</ol> 5. Digestión de tripsina Nota: las proteínas son digeridas para generar péptidos suitable para el análisis de abajo a arriba, espectrometría de masas (MS).
<ol><li>TDT añadir solución nuclear lisado (5 mm final); incubar durante 1 h a TA.</li>
	<li>Añadir Yodoacetamida de acción fresca (14 mM final); incubar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Diluir lisado con volumen 5 veces de 50 mM NH 4 HCO 3</li>
	<li>Añadir tripsina (μg proteína: μg tripsina = 200:1); incubar a 37 ° C durante la noche.</li>
</ol> 6. La desalación de péptidos <ol><li>preparar una punta de etapa por encargo por ejemplo.
	<ol><li>6.1.1. Coloque un disco de material de extracción C18 de fase sólida en la parte inferior de una pipeta de 200 μl.</li>
		<li>Añadir 50 μl de oligo R3 invertida resina de fase en la parte superior del disco de C18. Coloque la punta del escenario en centrifugación adaptador y la punta del lugar con el adaptador dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Agregar 100 μl 100% acetonitrilo en consejos para lavar. Centrifugar a 1000 x g durante 1 min eliminar el disolvente.</li>
		<li>Equilibrar con 50 μl 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto</li>
	</ol></li> <li>Agregar 100% de ácido fórmico a la muestra digerida la proteína para disminuir el pH a 2-3. 
	Nota: Esto debe requerir ~ 5 μL 1 mL de muestra diluida péptido, pero pH deberá ser medido y más fórmico ácido añadido si es necesario.</li>
	<li>Muestra de la carga en punta de etapa por encargo, centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto hasta que todos de la muestra pasa a través de la punta.</li>
	<li>Lavado obligado péptidos con 50 μl 0.1% TFA. Centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto</li>
	<li>Eluir péptidos mediante la adición de 50 μl de tampón de elución (75% acetonitrilo, 0.025% TFA) a punta del escenario y centrifugar a 1000 x g durante 1 min forzar el buffer de elución de la punta.</li>
	<li>Seco de la muestra utilizando una centrífuga de vacío a 150 x g y 1-3 kPa para 1 h. 
	Nota: Péptidos secas pueden almacenarse a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.</li>
</ol> 7. Extracción de ARN de reticulado Nota: tratar de péptidos con nucleasa para eliminar RNA reticulado.
<ol><li>Resuspender el precipitado en 50 μl de 2 x de buffer de nucleasa (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM de MgCl 2).</li>
	<li>Péptido medida concentración usando la absorbancia a 280 nm suponiendo que 1 mg/mL de péptidos para una A 280 de 1. 
	Nota: La concentración esperada es 1 mg/mL.</li>
	<li>Ajustar todas las muestras a 1 mg/mL y la concentración más baja con 2 x de buffer de nucleasa.</li>
	<li>Preparar una mezcla maestra de 50 μl de H 2 O + nucleasa de alta pureza de 1 μl (&#8805; 250 U) (consulte la Tabla de materiales) por ejemplo.</li>
	<li>50 μl de muestra del péptido y añadir 50 μl de H 2 O + nucleasa master mix.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C por 1 h. proceda realizar espectrometría de masas. 
	Nota: Los péptidos están ahora listos para espectrometría de masas. Pueden ser analizadas inmediatamente o almacenadas a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.</li>
</ol> 8. Nano de la cromatografía líquida espectrometría de masas y procesamiento de datos crudos Nota: porque 4SU-reticulación cambia la masa del péptido, sus iones no cuentan para la intensidad del péptido no reticulado en LC-MS/MS, por lo tanto, que parece ser disminuido por el entrecruzamiento. El grado y la consistencia de esta disminución refleja el grado de reticulación de proteínas-RNA para cada péptido 24.
<ol><li>HPLC preparar buffers como sigue: 0,1% de ácido fórmico en agua grado HPLC (tampón A), el ácido fórmico 0,1% en acetonitrilo grado HPLC (tampón B).</li>
	<li>Si un nano-HPLC está disponible, conecte una nano-columna con las siguientes especificaciones: diámetro interno 75 μm; lleno de partículas de C18-AQ; longitud 20-25 cm. 
	Nota: Si ejecuta el HPLC disponible a tasas de flujo más altas use un tamaño de columna adecuado para el caudal indicado. Cromatografía de flujo más alta disminuye sensibilidad.</li>
	<li>Programar el método HPLC como sigue: tarifa 250-300 nL/min de flujo, gradiente de 2 a 28% de tampón B en 120 min, del 28 al 80% B para los próximos 5 minutos e isocrática 80% B durante 10 minutos 
	Nota: Si el HPLC no tiene una columna automatizado equilibrado muestra previa de carga, inicie el programa con 10 min a 0% B antes de cargar la muestra.</li>
	<li>Programar el método de adquisición de MS para realizar adquisición de datos dependientes (DDA) como experimentos de proteomics de la escopeta estándar. El ciclo de trabajo del instrumento debe alternar exploraciones de MS completas con tandem MS exploraciones (o MS/MS) de las señales más intensas. Utilice la configuración óptima para proteómica MS funciona. 
	Nota: Para obtener resultados seguros, instrumentos de uso que pueden realizar por lo menos el MS completo de barrido en modo de alta resolución (e.g. orbitrap, tiempo de vuelo). Para la cuantificación precisa, asegúrese de que intervalos entre búsquedas completas de MS ya no son de 3 ciclos de trabajo más s. podrían impedir la definición exacta de los cromatogramas de iones extraídos.</li>
	<li>1-2 μg de muestra en la columna HPLC y ejecutar el método de HPLC-MS/MS como programado. Para cada repetición biológica realizar al menos dos carreras independientes y tratarlos como técnicos repeticiones.</li>
	<li>Después de MS, importar los archivos sin procesar en un paquete de software de proteómica para la identificación de espectros MS/MS y péptido cuantificación mediante cromatografía de iones extraídos. Recomendamos los paquetes de software que pueden realizar la alineación cromatográfica de múltiples MS funciona (véase la Tabla de materiales) 29 , 30.</li>
	<li>Si la opción está disponible en el paquete de software, habilitar &#34; partido entre carreras &#34; antes de comenzar el procesamiento de datos.</li>
	<li>Una vez finalizado el análisis, exportar la lista de péptidos junto con los valores de cuantificación.</li>
</ol>

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<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+U1+snRNP%2C+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle%2C+reveals+the+mechanism+of+5%27+splice+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe un protocolo experimental detallado para realizar la identificación de RBR en troncales y, con modificaciones apropiadas, en cualquier célula que puede incorporar 4SU RNA. Otros tipos de células pueden requerir optimización del enfoque para asegurar una suficiente relación señal a ruido. Además, mientras que el protocolo descrito aquí se centra en el examen de prácticas comerciales restrictivas nucleares, la tecnología de RBR-ID debe ser fácilmente adaptable a diferentes compartimentos celulares, como el cito...

El propósito del método RBR-ID es identificar nuevas proteínas de unión a RNA (restrictivas) y mapa de sus regiones de unión a RNA (RBRs) con resolución de péptido-niveles para facilitar el diseño de los mutantes de unión de ARN y la investigación de los biológicos y bioquímicos funciones de las interacciones proteína-RNA.
ARN es único entre biomoléculas como puede actuar como un mensajero lleva la información genética y también doblar en estructuras tridimensionales complejas con funciones bioquímicas más similares a los de las proteínas1,2. Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que RNAs noncoding (ncRNAs) desempeñan papeles importantes en varios genes vías reguladoras y epigenéticos3,4,5 y, por lo general, estas funciones reguladoras son mediadas en concierto con proteínas que interaccionan específicamente con un determinado RNA. De particular relevancia un conjunto de proteínas de interacción fue identificado recientemente para el ncRNA largo intensamente estudiado (lncRNA) Xist, proporcionando información valiosa sobre cómo este lncRNA interviene en la inactivación del cromosoma x en las células femeninas6,7 ,8. En particular, varias de estas proteínas interactúan Xist no contienen ningún canónica de dominios RNA-que ata9, y por lo tanto su actividad de unión de ARN no podía ser predicha en silico basado en su secuencia primaria solamente. Teniendo en cuenta que miles de lncRNAs se expresan en cualquier célula dada10, es razonable asumir que muchos de ellos pueden actuar vía interacciones con todo ser descubierto proteínas RNA-que atan (restrictivas). Una estrategia experimental para identificar estas nuevas prácticas comerciales restrictivas, por tanto, facilitaría enormemente la tarea de la función biológica de ncRNAs de disección.
Los intentos anteriores para identificar empíricamente restrictivas han dependido de polyA + RNA selección acoplada a espectrometría de masas (MS)11,12,13,14,15. Aunque estos experimentos muchas proteínas ha añadido a la lista de supuestas prácticas comerciales restrictivas, por diseño podría sólo detectan las proteínas a las transcripciones de la cofia. Sin embargo, más pequeño RNAs y muchos lncRNAs no son contra. 16 , 17 y sus proteínas interactuantes probablemente habría sido perdidas en estos experimentos. Un estudio reciente aplicado aprendizaje automático a las bases de datos del interactoma de proteínas para identificar proteínas que co purificaron con múltiples prácticas comerciales restrictivas conocidas y demostró que estos socios recurrentes de la RBP tenían más probabilidades de poseer actividades de unión de ARN18. Sin embargo, este enfoque se basa en la minería de bases de datos existentes de gran interacción y sólo puede identificar proteínas que pueden ser co purificadas en condiciones no desnaturalizantes con prácticas comerciales restrictivas conocidas, excluyendo así a partir del análisis insoluble, embebido en la membrana y escaseado proteínas.
La identificación de una proteína como un bona fide las prácticas comerciales restrictivas a menudo no producen automáticamente información sobre la función biológica o bioquímica de la interacción proteína-RNA. Para abordar este punto, es típicamente conveniente para identificar las proteína dominio y aminoácido residuos implicados en la interacción que mutantes específicos pueden ser diseñados para probar la función de enlace de RNA en el contexto de cada novela RBP19, 20. los esfuerzos anteriores de nuestro grupo y otros han utilizado fragmentos de la proteína recombinante y mutantes de la canceladura identificar RNA binding regiones (RBRs)19,20,21,22; sin embargo, estos enfoques son intensivas e incompatible con el análisis de alto rendimiento. Más recientemente, un estudio describe una estrategia experimental para actividades de unión de ARN en forma de alto rendimiento usando spectrometry total23; sin embargo, este enfoque se basó en una selección doble polyA + RNA y llevó así a las mismas limitaciones que los enfoques de identificación de las prácticas comerciales restrictivas descritas anteriormente.
Hemos desarrollado una técnica, denominada RNA enlace región identificación RBR-, que explota a proteína-RNA photocrosslinking y cuantitativo espectrometría de masas para identificar las proteínas y las regiones de la proteína interacción con RNA en células vivas sin hacer hipótesis sobre el estado de poliadenilación del RNA, así como prácticas comerciales restrictivas obligado a polyA-RNAs24. Además, este método se basa exclusivamente en la reticulación tiene ninguÌ n requisito en la solubilidad de la proteína o accesibilidad y es así conveniente para las actividades de unión de ARN dentro de las membranas (por ejemplo, la envoltura nuclear) o compartimentos poco solubles ( por ejemplo, la matriz nuclear). Describimos los pasos experimentales para realizar identificación de RBR para los núcleos de células madre embrionarias de ratón (troncales) pero con pequeñas modificaciones este protocolo debe ser conveniente para una variedad de tipos celulares, que pueden incorporar eficientemente 4SU de la cultura medio.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, origen estadounidense</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>solución de L-glutamina 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100 veces)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Solución de gelatina, 2% en agua</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-tiouridina</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM stock en agua</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Forma comercial de detergente octil-fenoxi-polietoxi-etanol</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado de secuenciación</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore disco de extracción en fase sólida</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 Reverso - Resina de fase</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 1133903 <td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>Nucleasa de alta pureza</td></tr><tr><td>Desmembrador sónico Modelo 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>descontinuado</td><td>actualizado con FB505110</td></tr><tr><td>Acetonitrilo de grado HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>Material de embalaje para columna de HPLC</td></tr><tr><td>Capilar para nano columnas (75 y micro; m)</td><td>Software Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Instituto Max Planck de Bioquímica</td><td></td><td>Puede realizar la alineación cromatográfica de múltiples ejecuciones de MS</td></tr></tbody></table>

preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de arn

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

RNAs noncoding desempeñan papeles importantes en varios procesos nucleares, incluyendo la regulación de la expresión génica, estructura de la cromatina y la reparación del ADN. En la mayoría de los casos, la acción de noncoding RNAs está mediada por proteínas cuyas funciones están reguladas a su vez por estas interacciones con RNAs noncoding. De acuerdo con esto, un número creciente de proteínas involucradas en funciones nucleares se ha divulgado para enlazar RNA y en algunos casos las regiones de unión de ARN de estas proteínas se ha asignado, a menudo a través de métodos laboriosos, basado en el candidato.
Aquí, Divulgamos un protocolo detallado para realizar una alto rendimiento, todo el proteoma identificación imparcial de sus regiones de unión de ARN y proteínas RNA-que atan. La metodología se basa en la incorporación de un análogo en el ARN celular, seguido por reticulación UV-mediado proteína-RNA y los análisis de espectrometría de masas para revelar RNA-reticulado péptidos en el proteoma de uridina fotoreactivos. Aunque Describimos el procedimiento de células madre embrionarias de ratón, el protocolo debe adaptarse fácilmente a una variedad de células cultivadas.

La figura 1 muestra el flujo de trabajo de RBR-ID. Debido a la reticulación relativamente baja eficiencia de esta técnica, es muy importante a tener en cuenta el nivel de agotamiento y la consistencia del efecto observado (P -valor) a través de réplicas biológicas. La figura 2 muestra una parcela de volcán de resultado RBR-ID. Péptidos que traslapó dominio de adorno (RRM) de reconocimiento de RNA Mostrar nivel de agotami...

Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar proteínas que se unen al ARN en células vivas y mapear sus regiones de unión al ARN mediante la fotoactivación cruzada mediada por UV seguida de espectrometría de masas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como qué reguladores epigenéticos están unidos al ARN y qué regiones proteicas son necesarias para las interacciones. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere la purificación de los complejos proteína-ARN, y por lo tanto necesita poca cantidad de material e identifica proteínas unidas a cualquier tipo de ARN.Como se presenta, este método se centra en las proteínas nucleares porque ese es nuestro interés científico, pero con modificaciones menores en los pasos de fraccionamiento, podría utilizarse para estudiar el ARN y las proteínas de unión en otros compartimentos celulares. Después de cultivar y expandir las CEM de ratón según el protocolo descrito, amplíe las células hasta el número requerido de placas de 10 centímetros. Antes de que las placas alcancen la confluencia, agregue cuatro SU directamente al medio hasta una concentración final de 500 micro molar.Deje las placas de control con 4sU sin tratar. Agite suavemente las placas para distribuir homogéneamente el 4sU en todo el medio y luego devuélvalas al mismo incubador de cultivo celular durante dos horas. La eficiencia de incorporación del 4sU varía entre los tipos celulares, por lo que podría ser necesario optimizar su concentración y el tiempo de incubación para garantizar un entrecruzamiento eficiente y minimizar la toxicidad.A continuación, transfiera las placas a un recipiente con hielo y deseche el medio. Luego, use 5 mililitros de PBS frío con hielo para enjuagar suavemente las placas. Añada 2 mililitros de PBS frío con hielo y coloque las placas sin tapa en un cruzador equipado con bombillas que emiten UV-B.Irradie las placas con una configuración de energía de 1 julio por centímetro cuadrado. La reticulación eficiente con UV es fundamental. Recomendamos utilizar luz UV-B, aunque también se puede usar UV-A.En cualquier caso, la cantidad de energía UV utilizada debe optimizarse y puede controlarse mediante PAR-CLIP o ChIRP. Utilice espátulas para células para recoger las células y transfiéralas a PBS frío en tubos cónicos. Luego, centrifugue las células a 2000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Elimine el sobrenadante y re-suspenda el botón celular en cinco mililitros de PBS frío con hielo que contenga 2 milimolares de EDTA y 0,2 milimolares de PMSF. Cuente las células utilizando un hemocitómetro. Espere de cinco a diez millones de células, y de diez a veinte millones de células, provenientes de placas de 10 centímetros y 15 centímetros, respectivamente.Luego, centrifugue las células a 2000 veces g y 4 grados centígrados durante cinco minutos. Para aislar núcleos de las células, prepare el tampón A frío con hielo según se describe en el protocolo del texto. Antes de usarlo, agregue 0,5 milimolar de DTT y 0,2 milimolar de PMSF a la cantidad deseada del tampón A. Añada 2 mililitros del tampón frío a las células para lavarlas, luego centrifugue las células a 2500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Descarte el sobrenadante y agregue tampón A suplementado con 0,2 por ciento de un detergente no iónico y no desnaturalizante; luego, rote la muestra a 4 grados celsius durante cinco minutos. Después de centrifugar las células a 2500 ×g durante cinco minutos, retire el sobrenadante. El sedimento contiene núcleos intactos libres de citoplasma.Para lisar los núcleos, agregue 200 microlitros de tampón de lisis al tubo. Utilice una sonda de 1/8 de pulgada para sonicar la muestra y romper la cromatina con una amplitud del 50 por ciento durante cinco a diez segundos. Centrifugue la muestra a 12000 ×g durante cinco minutos y recoja únicamente 175 microlitros del sobrenadante para evitar tocar el precipitado.A continuación, mida la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford o una técnica similar. Luego, utilice tampón de lisis para diluir la proteína en las diferentes muestras a 1 miligramo por mililitro o a la concentración más baja entre las muestras. Añada solución de DTT 5 milimolar al lisado nuclear e incube la muestra a temperatura ambiente durante una hora.Luego, agregue 14 milimolar de yodoacetamida del stock recién preparado e incube el lisado a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Diluya el lisado con cinco volúmenes de bicarbonato de amonio 50 milimolar, luego agregue tripsina. Incube la muestra a 37 grados Celsius durante la noche.Para preparar una punta personalizada por muestra, coloque un disco de material C18 de extracción en fase sólida en el fondo de una punta de pipeta de 200 microlitros. Añada 50 microlitros de resina inversa Oligo R3 encima del disco de C18, luego coloque la punta en un adaptador de centrifugación y coloque el adaptador dentro de un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada 100 microlitros de acetonitrilo al 100 por ciento a las puntas para lavarlas.Luego, centrifugue las puntas a 1000 × g durante un minuto para eliminar el solvente. Equilibre las puntas con 50 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1 por ciento o TFA. A continuación, centrifugue nuevamente.Añada ácido fórmico al 100 por ciento a la muestra de proteína digerida para reducir el pH a entre 2 y 3. A continuación, cargue la muestra en una punta de columna casera y centrifugue la muestra a 1000 ×g durante un minuto hasta que toda la muestra atraviese la punta. Lave los péptidos retenidos con 50 microlitros de TFA al 0,1 por ciento.Luego, después de centrifugar la muestra a 1000 veces g durante un minuto, eluir los péptidos agregando 50 microlitros de tampón de elución al extremo del puntero y centrifugar a 1000 veces g durante un minuto para forzar la salida del tampón de elución del puntero. Utilice un centrífugo al vacío ajustado a 150 veces g y de 1 a 3 kilopascales durante una hora para secar la muestra. Para eliminar el ARN entrecruzado de la muestra, re-suspenda el precipitado en 50 microlitros de tampón de nucleasa 2x.Mida la concentración del péptido a 280 nanómetros asumiendo 1 miligramo por mililitro de péptidos para un A280 de 1. Use tampón 2x de nucleasa para ajustar todas las muestras a 1 miligramo por mililitro o a la concentración más baja, luego prepare una mezcla maestra de 50 microlitros de agua más 1 microlitro de nucleasa de alta pureza por muestra. Combine 50 microlitros de la muestra de péptido con 50 microlitros de agua más la mezcla maestra de nucleasa.A continuación, incubar la muestra a 37 grados Celsius durante una hora. Finalmente, realizar la cromatografía líquida en nanoescala, espectrometría de masas y procesamiento de datos según el protocolo descrito en el texto. Esta figura muestra un gráfico de volcán de un resultado de RBR id obtenido a partir de CSE de ratón.Los péptidos que se superponen con un dominio de motivo de reconocimiento de ARN aparecen en azul y muestran niveles de agotamiento altamente consistentes. Un péptido de unión al ARN de HNRNPC se resalta en rojo. Aquí se muestra un mapa de calor de las puntuaciones id RBR, que se calculan como una estimación de la probabilidad de unión al ARN de una región proteica.La puntuación se proyecta sobre la superficie de la subunidad del espliceosoma U1-70k. El color rojo brillante en las proximidades del contacto con el ARN, tal como se determinó mediante la estructura cristalina, indica la identificación correcta de la interacción proteína-ARN. En esta figura, TET2 se presenta como una nueva proteína de unión al ARN (RBP) y la actividad de unión al ARN se localiza en una región C-terminal mediante la representación gráfica de la puntuación del identificador RBR a lo largo de la secuencia primaria de la proteína.Finalmente, el requisito para este nuevo RBR podría verificarse mediante la realización de PAR-CLIP utilizando la secuencia de tipo silvestre y comparando la señal con la de un mutante que carezca del RBR predicho. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete u ocho horas distribuidas en dos días si se lleva a cabo correctamente. Antes del entrecruzamiento, las células pueden estimularse con diversos tratamientos para responder preguntas adicionales, como cómo comienza la diferenciación o cómo regula el ciclo celular las interacciones entre ARN y proteínas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar extras que contengan complejos de proteína ARN entrecruzados para identificar sitios de interacción proteína ARN mediante espectrometría de masas.

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

El protocolo proporciona instrucciones para modificar el ARN con sulfato de dimetilo para experimentos de perfiles mutacionales. Incluye sondeo in vitro e in vivo con dos métodos alternativos de preparación de bibliotecas.

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Aprenda a identificar proteínas de unión a ARN en células vivas mediante fotoreticulación UV y espectrometría de masa. Este método permite mapear regiones de unión sin necesidad de purificación previa.

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