Name: Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda un método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de ivacaftor, lumacaftor y sus metabolitos en muestras clínicas de pacientes con fibrosis quística. Esta técnica facilita el monitoreo terapéutico de fármacos.

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J.L. y T.V. son apoyados por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud (R01 AI111965). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas o los institutos nacionales de salud. MC es un investigador australiano NHMRC Principal. J. L. es nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (NHMRC) Senior Research Fellow, y T.V. es un australiano NHMRC industria carrera desarrollo nivel 2 investigador. E.K.S es un 2017 joven Embajador designado para ASM (sociedad estadounidense de Microbiología) y es apoyado por la concesión australiana del postgrado. Partes de este trabajo fue presentado en la 12th Conferencia incesante en la Fibrosis quística en Melbourne (5-8th de agosto de 2017).

aprobación de ética se obtuvo de Monash University humano investigación ética Comité (MUHREC).
 1. aplicación de la prueba: toma de muestras de paciente <ol><li>registrar el tiempo cuando el paciente toma la dosis estándar de 150 mg el ivacaftor o ivacaftor 125 mg /lumacaftor 200 mg.</li>
	<li>Nota abajo el tiempo exacto cuando se recoge la muestra de sangre del paciente. 
	Nota: Se recomienda recoger muestras de 4-5 en un transcurso de tiempo 24 h. Si la colección de solo muestra es posible, el momento indicado es 2.5-4 h post ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinación de dosificación como C máximo las concentraciones en estado estacionario será alcanzables después de &#62; 5 días de tratamiento consecutivo.</li>
	<li>Recoger 4-5 mL de sangre en tubos azul sin tratamiento disponibles en el mercado.</li>
	<li>Después de la recolección de la sangre, que la sangre coagule dejando tranquilo a temperatura ambiente. 
	Nota: Esto generalmente toma 15-30 minutos</li>
	<li>Eliminar el coágulo por centrifugación a 1.000-2.000 x g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga refrigerada. Designar el sobrenadante resultante como plasma.</li>
	<li>Después de centrifugación, inmediatamente transferir el sobrenadante (plasma) en un tubo limpio de polipropileno con una pipeta Pasteur. Etiqueta el plasma del tubo con el ID del paciente (p. ej., paciente 1), el medicamento administrado (por ejemplo, combinación de ivacaftor-lumacaftor) y tiempo de la muestra del paciente fue recogida (p. ej., dosis después de 2,5 h).</li>
	<li>Mantener las muestras a 2-8 ° C durante la manipulación. Una vez terminado el tratamiento, almacenar las muestras en &#8211; 20 ° C.</li>
	<li>Si es necesario, enviar las muestras con un mensajero aprobado al Instituto análisis. 
	Nota: Las muestras deben enviarse en hielo seco hasta su llegada y debe mantenerse en &#8211; 80° C hasta análisis.</li>
</ol> 2. Preparación y procesamiento de muestras efectuados y normas Nota: Plasma de donantes sanos ingenuos al ivacaftor/lumacaftor tratamiento se obtuvo de la Cruz Roja australiana. Para asegurar la integridad, todas las muestras y normas debe mantenerse a 2-8 ° C durante la recolección y procesamiento. Una vez terminado el tratamiento, almacenar las muestras en &#8211; 20 ° C.
<ol><li>Pesar IVA, IVA-carboxylate, hidroximetil-IVA y LUMA que servirá como referencia para los estándares internos.</li>
	<li>Preparar dos soluciones independientes de cada analito (IVA, M1, M6 y LUMA) en metanol de grado LC-MS en 100 μg/mL y 10 μg/ml. 
	Nota: Los compuestos expirará después de 10 días en el escritorio.</li>
	<li>Recién preparar LC-MS, patrones de calibración antes de cada serie analítica mediante la dilución de los estándares de calibración soluciones en plasma humano para lograr a raíz de las concentraciones: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10.0 μg/mL. Estas muestras se denominan normas.</li>
	<li>Para precipitar proteínas, preparar 0.1% de ácido fórmico (FA) en acetonitrilo (ACN, grado de LC-MS) y deja en el refrigerador hasta que sea necesario.</li>
</ol> 3. Tratamiento previo de muestras efectuados y normas <ol><li>tanto muestras de plasma del paciente y en blanco se equilibren a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vortex para mezclar cada muestra de plasma de 15 s por ejemplo.</li>
	<li>Transfiera una alícuota de 100 μl de cualquiera plasma sin estándares o muestras para análisis en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir el IVA estándar interno en cada uno de los tubos estándar (por ejemplo, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10.0 μg/mL para cubrir el potencial rango de concentración), cierre la tapa y vortex por 2-3 s. Nota esa norma interna es sólo Añadida al plasma en blanco y no estándar interno se agrega a las muestras del paciente.</li>
	<li>Repita el paso 3.4. de los otros estándares internos M1, M6 y LUMA.</li>
	<li>Vuelta abajo cada tubo brevemente para asegurar que hay no hay gotas en la tapa de.</li>
	<li>Añadir 200 μL de la mezcla de 0.1% FA en ACN en cada tubo para precipitar las proteínas del plasma.</li>
	<li>Vórtice la mezcla vigorosamente durante 15 s.</li>
	<li>Tubos reposar 10 minutos en el refrigerador.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° C, si es posible.</li>
	<li>Filtrar una alícuota de 200 μL del sobrenadante a través de un filtro de la jeringuilla de 13 m m en un frasco HPLC de 1.5 mL.</li>
	<li>Transferir 100 μl del sobrenadante en el frasco de LC-MS para el análisis de HPLC-MS.</li>
</ol> 4. El análisis por HPLC-MS Nota: HPLC-MS el análisis fue realizado en un sistema LC-MS juntado con el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (tabla 1).
<ol><li>Vuelta en el sistema LC-MS, coloque la bandeja con las muestras en el dechado auto.</li>
	<li>Fijar la columna en una columna de guardia y conectar al sistema LC-MS.</li>
	<li>Conectar dos botellas de fases móviles (botella A: 100% ACN; botella B: 0,1% ácido fórmico en agua) y equilibrar el sistema LC-MS.</li>
	<li>Incorporar a los siguientes parámetros en el protocolo de LC-MS.
	<ol><li>Divide el flujo de fase móvil antes de entrar en el espectrómetro de masas en una proporción 2:1 (residuos: entrada de MS).</li>
		<li>Realizar una elución gradiente a un flujo de 0,5 mL/min utilizando una fase móvil que consiste en 100% ACN y 0.1% de ácido fórmico en agua (40: 60, el punto de partida v/v). Tenga en cuenta que el porcentaje de volumen de la fase móvil cambia a lo largo del análisis.</li>
		<li>Operar el espectrómetro de masas en modo de ionización por electrospray positivo.</li>
		<li>Asegúrese de que los valores de LC-MS son los siguientes: voltaje de spray ion 4,5 kV, energía de la colisión 295.9 V, nebulización gas: nitrógeno a 3 L/min, gas de colisión: argón; secado gas caudal 20 L/min, voltaje Q3 de la lente:-22 V, desolvation temperatura 250 ° C con un bloque de calor temperatura de 400 ° C.</li>
		<li>Volumen de inyectar 10 μl por muestra.</li>
		<li>Detectar analitos usando la reacción múltiple (MRM) de monitoreo. Seguimiento de las transiciones del ion de m/z 392.49 &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 y m/z 452.40 &#8594; 453 para IVA, IVA-M1, M6 IVA y LUMA, respectivamente. 
		Nota: El método recientemente optimizado aún tiene que ser plenamente validado según estándares de la FDA.</li>
	</ol></li></ol> 5. Curvas de calibración <ol><li>construir la LC-MS curvas de calibración antes de cada serie analítica usando la relación entre las proporciones de área de pico de cada uno de los cuatro analitos a estándar interno y las calibración estándar nominal las concentraciones de El ivacaftor (IVA-M1, M6 IVA o LUMA) dentro del programa de configuración de LC-MS. 
	Nota: Los pasos exactos para la construcción de la curva de calibración es dependiente en el modelo de equipo LC-MS se utiliza. Esta información puede estar disponible en el manual del equipo.</li>
	<li>Realizar el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados ponderando 2 según el recíproco de las concentraciones de.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
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<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
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<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
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<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como se informó anteriormente, nuestro grupo tiene por primera vez desarrollado y validado un método de HPLC y LC-MS para la detección y cuantificación de ivacaftor y sus principales metabolitos hidroximetil-IVA M1 (activo) y el IVA-carboxylate M6 (inactivos); y lumacaftor en el plasma y el esputo de pacientes de CF14. El análisis divulgado previamente por nuestro grupo fue utilizado con éxito para cuantificar la concentración de LUMA, IVA, IVA-M1 y M6 de IVA en el plasma y el esputo de pacientes ...

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética común que implica las glándulas exocrinas de la mucosa del pulmón, hígado, páncreas y los intestinos causando insuficiencia multiorgánica progresiva, como una disminución en la función pulmonar y la insuficiencia pancreática1, 2,3. Ivacaftor (IVA) es el primer Food and Drug Administration (FDA-US) y Agencia Europea de medicamentos (EMA) aprobó fibrosis quística trans membrana conductancia regulador (CFTR) potenciador de drogas, con eficacia clínica se manifiesta produciendo un significativo mejora la función pulmonar en comparación con placebo en un pequeño subgrupo de pacientes con FQ teniendo la G551D-CFTR [glicina (G) en posición 551 es reemplazado por ácido aspártico (D)] mutación sin sentido (~ 4-5% de la población de CF)4,5. Esto administrados por vía oral drogas aumenta el canal CFTR abriendo, así aumentar el flujo de iones de cloruro y actuando sobre el defecto primario que conduce a las manifestaciones clínicas de CF4,6. Lamentablemente, IVA monoterapia no es eficaz en pacientes con la mutación más común de F508del homocigótica [en canceladura del marco del gen CFTR que se traduce en la pérdida de la fenilalanina (F) en la posición 508] que resulta en mal plegada CFTR, que se observa en ~ 50% de la población de CF7,8.
Recientemente, la FDA otorgó la aprobación para combinar IVA con el corrector CFTR lumacaftor drogas. La inteligente estrategia de combinar un corrector CFTR (lumacaftor LUMA) que rescata la F508del-CFTR a la superficie de la célula con un modulador (IVA) que potencia la actividad del canal CFTR, efectivamente se expande la ventana de tratamiento a la mayoría de la población de CF5 . Sigue habiendo preguntas sobre si estos fármacos cumplirá su promesa como un número de informes contradictorios han emergido poner en duda sobre su eficacia clínica9,10. Además, mejoras en la función pulmonar fueron sólo modesto (2.6-4% para combinación ivacaftor-lumacaftor) en comparación con el éxito alcanzado con la monoterapia en pacientes con una mutación (10.6-12,5%) de G551D8de IVA. Posibles interacciones de fármacos antagonistas entre IVA y LUMA que limitan potencialmente la eficacia clínica de la combinación lumacaftor ivacaftor provienen de sus propiedades farmacocinéticas ideal menos de7,11. IVA es ampliamente metabolizada por las enzimas del citocromo P450 (CYP), principalmente a un metabolito activo hidroximetil-IVA (IVA-M1, M1) y una forma inactiva de7,IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)12. El inductor de CYP3A4 LUMA, por otro lado, no se metaboliza extensamente y en gran parte se excreta inalterado en la heces11. Como inductores de CYP3A4 inducen metabolismo del citocromo, se podrían reducir concentraciones ivacaftor (sustrato de CYP3A4). Por otra parte, tanto el IVA como LUMA son moléculas muy hidrofóbicas y están obligado ~ 99% a proteínas plasmáticas, que limita significativamente la concentración de libre de drogas (activo)1,13.
Colectivamente, estos factores pueden ser que se reúnen para limitar la eficacia clínica de la combinación de ivacaftor-lumacaftor. No se sabe si se alcanzan las concentraciones plasmáticas óptimas bajo el actual régimen de dosificación para el ivacaftor-lumacaftor combinación o si el umbral terapéutico se mantiene8. Actualmente, hay una escasez de información sobre los parámetros farmacocinéticos como el pico y las concentraciones plasmáticas de estado estacionario de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dado el notable metabolismo de ivacaftor y lumacaftor, seguimiento de las relaciones exposición-respuesta es requisito para alcanzar regímenes de dosis óptima para tratamiento ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Nuestro grupo ha publicado recientemente el primer método HPLC, LC-MS para la supervisión de las relaciones exposición-respuesta de IVA y LUMA14. No hay técnicas alternativas de medición de las concentraciones de ivacaftor, sus metabolitos y lumacaftor se han divulgado hasta la fecha. Para permitir el análisis de alto rendimiento de un colectivo de pacientes mayor y para reducir drásticamente el tiempo de análisis, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño y un sistema solvente degradado que reduce costos y tiempos en marcha.

<table><tbody><tr><td>IVA (Cat#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (Estados Unidos).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Cat#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (Estados Unidos).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carboxilato de IVA (Cat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canadá).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hidroximetil-IVA (Cat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canadá).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (MeOH, grado LC-MS),&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo (ACN, grado LC-MS)&nbsp;</td>Ácido fórmico <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de triple cuadrupolo Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2.6 y micro; m C8 100 &Aring;; 50 y veces; 2,1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(Filtro en línea KrudKatcher Ultrea HPLC, filtro de profundidad de 0,5 m x 0,004 pulgadas de diámetro interior).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de polipropileno (VWR) de 1,5 mL.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa de 13 mm (0,45 y micro; m nylon, GRACE, EE. UU.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 y micro; L, tabiques de PTFE/silicona].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método optimizado de lc-ms/ms para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de ivacaftor, sus principales metabolitos y lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con fibrosis quística

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defectos en el regulador de conductancia trans membrana de fibrosis quística (CFTR) son la causa de la fibrosis quística (FQ), una enfermedad con manifestaciones pulmonares mortales. El ivacaftor (IVA) y combinación de ivacaftor-lumacaftor (LUMA) son dos nuevos medicamentos avance CF que modulan directamente la actividad y el tráfico de la proteína CFTR defectuosa. Sin embargo, todavía hay una falta de entendimiento en los parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos y la farmacología de ivacaftor y lumacaftor. La técnica de HPLC-MS para el análisis simultáneo de las concentraciones de ivacaftor, hidroximetil-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate y lumacaftor en fluidos biológicos en pacientes que reciben la combinación estándar de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia ha sido desarrollada por nuestro grupo y validado parcialmente a las normas de la FDA. Sin embargo, para permitir el análisis de alto rendimiento de un mayor número de muestras de pacientes, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño (2.6 μm, C8 100 Å; 50 x 2,1 mm) y un sistema solvente degradado ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: en 70% B; 2.7-2,8 min: 70-90% de B; 2,8-4,0 min: 90% lavado de B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1 6.0 min: en 40% B) en lugar de una elución isocrática. El objetivo de este estudio era reducir el tiempo de análisis HPLC-MS por muestra dramáticamente de ~ 15 minutos a sólo 6 minutos por muestra, que es esencial para el análisis de una gran cantidad de muestras de pacientes. Este método conviene será de gran utilidad para estudios en las relaciones exposición-respuesta de estas drogas de CF de avance.

Recientemente hemos reportado un método, validado parcialmente a las normas de la FDA, en un triple cuadrupolo LC-MS y un sistema de detector HPLC, usando una columna C8 (5 μm, 3,9 x 50 mm diámetro interior) con la fase móvil que consiste en 100% ACN y 0.1% de ácido fórmico en agua (40: 60 v/v) con un caudal de 1 mL/min. Se observó una correlación linear de los picos sobre un rango de concentración de 0,01 a 10 μg/mL en plasma humano para todos los metabolitos, ivacaftor, Iva-M1, M6 Iva y lumacaftor14</...

Combinación de ivacaftor y ivacaftor lumacaftor son dos nuevos fármacos de CF. Sin embargo, todavía hay una carencia de entendimiento sobre su PK/PD y farmacología. Presentamos una técnica de HPLC-MS optimizada para el análisis simultáneo de ivacaftor y sus principales metabolitos y lumacaftor.

Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Este es el protocolo para la preparación de muestras para el ensayo de plasma. Tenga en cuenta que, para garantizar su integridad, todas las muestras y estándares deben mantenerse entre dos y ocho grados Celsius durante la recolección y el procesamiento. Una vez finalizada la manipulación, almacene todas las muestras a menos 20 grados.Para la preparación estándar, prepare dos soluciones stock independientes de cada anilida, ivacaftor, metabolito M1, metabolito M6 y lumacaftor en metanol a 100 microgramos por mililitro y 10 microgramos por mililitro. Tenga en cuenta que los compuestos caducan después de 10 días en la mesa de trabajo. Para los estándares, transfiera 100 microlitros de plasma humano a tubos de microcentrifugado de polipropileno de 1,5 mililitros.Continúe haciendo esto con todas sus demás muestras. Luego agregue el patrón interno a cada tubo. Por ejemplo, elegimos 0,01 microgramos por mililitro del patrón preparado.Ahora este tubo contiene plasma con el estándar interno añadido. Proceda de esta manera con todos los demás estándares. Tome sus estándares y centrifúguelos durante unos segundos para asegurarse de que todo el líquido esté en la parte inferior del tubo.Continúe haciendo esto para todos sus 40 estándares. Para las muestras de pacientes, transfiera 100 microlitros desde el tubo de muestra de paciente al tubo de microcentrifuga. La muestra real del paciente no está enriquecida con estándar interno.Centrifugar la muestra del paciente durante unos segundos para asegurarse de que todo el líquido esté en la parte inferior del tubo. Los siguientes pasos están diseñados tanto para las muestras como para los patrones. Añadir 200 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo a cada tubo de muestra para precipitar las proteínas plasmáticas.Continúe haciendo esto con todos los patrones y muestras de pacientes. Vortexe cada muestra vigorosamente durante aproximadamente 15 segundos. Continúe haciendo esto con todos los patrones y muestras analizadas.Dejar reposar durante 10 minutos en el refrigerador para facilitar la precipitación. A efectos demostrativos, centrifugaré solo una muestra y un estándar. Estamos centrifugando a 10.000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Eppendorf Centrifuge 5430 a cuatro grados.Ahora filtraremos el sobrenadante en los viales de Phenomenex. Para ello, estamos utilizando un filtro de jeringa de 13 milímetros con filtros de nailon Grace de 0,45 micrómetros adquiridos en EE. UU., y estamos filtrando hacia los viales para HPLC que pueden contener 1,5 mililitros. Después de la filtración, transferiremos 100 microlitros del sobrenadante a los viales para LC/MS para el análisis por LC/MS.Esta muestra ya está lista para el análisis. Ahora coloque simplemente todas sus muestras en el portaviales. Estamos utilizando un sistema LC/MS Shimadzu 8030, acoplado a un espectrómetro de masas con triple cuadrupolo.Deje que el sistema alcance el equilibrio antes del análisis. Una vez equilibrado, lo que tarda aproximadamente 15 minutos, simplemente presione el botón Inicio. Para cada metabolito, construya una curva de calibración trazando las relaciones del área de los picos de las anilidas frente a la concentración nominal de los estándares de calibración.Utilice la ecuación de regresión de la curva de calibración para calcular las concentraciones de anilidas en la muestra analizada. En esta figura se muestra un cromatograma típico. Se obtuvo una resolución cromatográfica optimizada utilizando una fase móvil de acetonitrilo al 100 % y ácido fórmico al 0,1 % en agua, con una elución en gradiente en una columna Phenomenex Kinetex C8.Los tiempos de retención en CL fueron los siguientes. Para M6, un minuto. Para M1, 1,3 minutos.Para ivacaftor, 1,55 minutos. Para lumacaftor, 2,3 minutos. En todas las muestras de plasma en blanco, no se observó interferencia con el tiempo de retención de cualquiera de las anilidas, ni se detectó interferencia proveniente de la combinación de ivacaftor con lumacaftor.Mediante el análisis de alto rendimiento de una gran cantidad de muestras de pacientes, hemos optimizado nuestro método descrito utilizando una columna de cromatografía de fase reversa con un tamaño de poro más pequeño, la columna Phenomenex C8, y un sistema de solventes en gradiente en lugar de la elución isotécnica actual. Esto reduce el tiempo de análisis a seis minutos por muestra, incluyendo la fase de lavado. Este método fiable y novedoso ofrece un enfoque sencillo, sensible y rápido para el monitoreo terapéutico de ivacaftor y la combinación de ivacaftor-lumacaftor en fluidos biológicos.Dado la necesidad de desarrollar relaciones exposición-respuesta para maximizar la eficacia de los medicamentos y al mismo tiempo contener los costos de la atención médica, se deben desarrollar y validar herramientas más sensibles para ayudar a los clínicos a utilizar terapias basadas en evidencia y técnicas analíticas de alto rendimiento en pacientes que padecen fibrosis quística. Al aplicar el método analítico propuesto a estudios clínicos de farmacocinética y farmacodinamia, surge la oportunidad de investigar más a fondo los parámetros farmacocinéticos del ivacaftor o de la combinación ivacaftor-lumacaftor en un colectivo de pacientes más amplio.

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Research

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Medicine

El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo.  Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Aquí describimos un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para cuantificar el inmunosupresor tacrolimus en manchas de sangre seca utilizando un paso simple de precipitación manual de proteínas y extracción en columna en línea.

Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

Competencia metabólica de los sistemas in vitro es un requisito clave para la biotransformación y la disposición de fármacos y sustancias tóxicas. En este protocolo, se describe la aplicación de sondas metabólicos de referencia para evaluar la fase I metabolismo en cultivos celulares.

La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultivos Celulares

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Aquí describimos un método de alto rendimiento para farmacovigilancia integral que permite mejorar la resolución y detección de paneles grandes de drogas de abuso y sus metabolitos, con control de calidad basado en siguientes inyección capilar electroforesis-espectrometría de masas.

Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en MZmine, es un enfoque elegante de postadquisición para la pantalla de datasets LC-MS/MS para clases enteras de productos naturales conocidos y desconocidos. Esta herramienta busca espectros MS/MS para los iones de producto y/o pérdidas neutrales que el analista ha definido como diagnóstico para toda la clase de compuestos.

Descubrimiento de producto natural con filtrado de fragmentación de diagnóstico LC-MS/MS: aplicación para análisis de Microcystin

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Los métodos actuales para analizar la adherencia de los pacientes a regímenes complejos de tuberculosis farmacorresistente (DR-TB) pueden ser inexactos e intensivos en recursos. Nuestro método analiza el cabello, una matriz fácilde de recoger y almacenar, para concentraciones de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar los niveles de fármacos subnanogramos que se pueden utilizar para entender mejor la adherencia a los medicamentos.

Panel LC-MS/MS validado para cuantificar 11 medicamentos resistentes a la tuberculosis en muestras de pelo pequeño

Aquí se describe un protocolo para la determinación de cuatro metabolitos triptófanos diferentes generados en la vía kynurenina (kynurenina, 3-hidroxikynurenina, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxiyanthranilic) en el medio recogido de cultivos celulares cancerosos analizados por cromatografía líquida junto con una sola espectrometría de masa cuadrúpeda.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

Los protocolos describen métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplados al índice de refracción o a la detección espectrométrica de masas para estudiar reacciones metabólicas en sistemas complejos libres de células basados en lisato.

Cromatografía líquida acoplada a la detección de índice de refracción o espectrometría de masas para perfiles de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisato

Aprenda un método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de ivacaftor, lumacaftor y sus metabolitos en muestras clínicas de pacientes con fibrosis quística. Esta técnica facilita el monitoreo terapéutico de fármacos.

Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística (Video) | JoVE Journal

Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

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