Name: Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda un método mejorado para recolectar líquido cefalorraquídeo en ratones anestesiados utilizando un micromanipulador. Esta técnica minimiza la contaminación sanguínea y permite obtener muestras puras para el análisis de biomarcadores en enfermedades neurológicas.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81650110527, 81371400) y nacional clave básica de investigación programa de China (2013CB530900).

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las políticas de la sociedad para la neurociencia (USA) y comités de ética de la Universidad de Fudan (Shanghai, China). Este procedimiento es una cirugía no supervivencia.
1. instalación de aparatos de la colección de LCR
<ol><li>Tire el vaso capilar (diámetro interno 0, 75 mm, diámetro externo de 1,0 mm) utilizando un extractor de micropipeta (como se muestra en Liu et al. 10; tubo capilar afilado se muestra en la figura 1).</li>
	<li>Lugar un capilar en el porta capilar de vidrio afilado montado firmemente en un micromanipulador (figura 1A).</li>
	<li>Romper la punta del tubo capilar afilado con pinzas rectas con un microscopio de disección, por lo que el diámetro interno de la punta rota es de 10-20 μm (figura 1).</li>
	<li>Conecte una jeringa y un tubo delgado en el otro extremo del soporte del tubo capilar y conecte la jeringa y la sonda delgada con una válvula de tres vías.</li>
	<li>Cambiar la válvula de tres vías para abrir y hundir la jeringa para soplar aire de la jeringa a través del tubo para el capilar para expulsar cualquier contaminante y crear la presión positiva en el tubo capilar de vidrio.</li>
	<li>Repita esto unas cuantas veces por dis-conectar y volver a conectar la jeringa a la válvula de tres vías y elaborar la jeringa ~ 100-200 μL antes de la última re-conexión de la jeringa con la válvula de tres vías (figura 1B).</li>
	<li>Mueva el instrumental quirúrgico con el capilar de vidrio al lado para evitar daños durante la disección del ratón.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig1.jpg"> Figura 1. Microscopio, instrumental quirúrgico y configuración capilar. (A) microscopio e instrumental quirúrgico con tubo capilar unida de configuración, así como una imagen más cercana de (B) la jeringa conectada y la válvula de tres vías para abrir (mostrado aquí) o cierre la tubería y (C) una intacta (derecha) y rota (izquierda) Punta capilar lista para recolección de LCR. Una vez roto, la punta del tubo capilar debe tener un diámetro interno de 0,75 mm, diámetro externo de 1,0 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. ratón disección
<ol><li>Anestesiar el ratón. Nota: para este protocolo, C57BL/6 y amiloide precursora proteínas/presenilin 1 (aplicación/PS1) transgénicos (modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer) de ratones fueron utilizado y anestesiado con hidrato de cloral 4% (en dH20) a 10 μl/g de peso del ratón vía intraperitoneal inyección.</li>
	<li>Cuando completamente anestesiados, asegúrese de que el ratón es adecuadamente anestesiado. La respuesta de retirada a los pies, pizca, ligeramente extendiendo los miembros posteriores y pellizcos de los dedos del pie y observando una respuesta de retirada, se realiza para asegurar la anestesia adecuada. Compruebe pellizcando las cuatro extremidades; Si no hay reacción el ratón correctamente está anestesiado. Corte y recorte el pelo en la parte posterior de la cabeza del ratón por encima de los ojos, entre las orejas a la parte inferior del cuello usando tijeras de disección (figura 2A). Por otra parte, clippers o crema depilatoria puede utilizarse para ayudar en la eliminación del vello.</li>
	<li>Fije la cabeza del ratón utilizando un adaptador de ratón (la parte posterior de la cabeza hacia arriba con la nariz apuntada hacia abajo en el ~ 45 °, figura 2A). Fijar barras de oído entre los oídos y los ojos del ratón y apriete. Asegúrese de que la cabeza no se mueva y esté asegurada firmemente en el adaptador presionando suavemente hacia abajo sobre la cabeza del ratón.</li>
	<li>Vuelva a verificar la respuesta de retirada para dedo pellizco antes de realizar la incisión quirúrgica y regularmente después de eso para asegurar el plano quirúrgico de anestesia. Observe visualmente cualquier cambio en la frecuencia respiratoria durante el proceso de indicar cambios en los planos de la anestesia. Una técnica limpia, aséptica, puede utilizarse para esta cirugía no supervivencia corta. Usando tijeras y pinzas curvas, corte a través de la piel y la primera capa del músculo hasta la base del cráneo está expuesta con sólo una capa delgada de músculo. Nota: Corte a través de la piel de ratón en la parte posterior del cuello y luego se corta la piel a la mitad del cráneo entre las orejas y los ojos del ratón. Piel y el tejido pueden entonces tirar aparte y fuera de la zona sobre la cisterna magna.</li>
	<li>Mientras que la observación mediante el microscopio de disección, diseccionar cuidadosamente lejos el último delgadas capas de músculo sobre la base del cráneo con unas pinzas y mover estas capas de músculo en el lado y fuera del área de interés. Si hay sangrado, utilizar bastoncillos de algodón para eliminar y ayudar a detener el sangrado.</li>
	<li>Una vez que se expone la dura sobre la cisterna magna (forma triangular con 1-2 vasos sanguíneos recorren la zona; ambos lados o entre los vasos sanguíneos son ser óptimo para la inserción capilar y recolección de LCR, figura 2B), utilizar un mojado bastoncillo de algodón para limpiar la membrana y luego use un bastoncillo de algodón seco para secar el área.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig2.jpg"> Figura 2. Configuración del ratón y la disección con imágenes representativas de la inserción capilar para recolección de LCR. Configuración del ratón listo para la extracción de la CSF con (A) afeitó la cabeza sujetada en su lugar para disección y (B) una detallada imagen (vista de 10 x) de una dura ratón disecado que la cisterna magna (Flecha discontinua muestra un vaso sanguíneo por la zona y Flecha sólida muestra área óptima para la inserción capilar). Imágenes detalladas (vista de 10 x) de (C) afilan la punta del capilar de vidrio contra la dura de la cisterna magna, (D) el punto en el cual el capilar pinchazos casi dura, con alguna resistencia de dura y (E) la punta capilar aprovechada a través de la duramadre para recoger CSF. CSF debe ser un líquido claro en el capilar de vidrio (flecha punteada). Todas las barras de escala en la parte inferior derecha de cada imagen de microscopio indican 100 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. CSF colección de ratón anestesiado
<ol><li>Alinee el tubo capilar de vidrio en la parte posterior de la cabeza de ratón para que el afilado es justo detrás de la membrana en un ~ ángulo de 30-45 ° (figura 2).</li>
	<li>Sumir la jeringa una vez o unas cuantas veces y elaborar la jeringa ~ 100-200 μl (para asegurarse de que no son contaminantes y hay presión negativa en el vaso capilar).</li>
	<li>Mediante el micromanipulador, mueva el tubo capilar punta cerca de la membrana hasta que la resistencia puede verse, pero lo (Figura 2D) pinchar no.</li>
	<li>Una vez que la resistencia se ve entre la extremidad del tubo capilar y la membrana, golpee suavemente el tubo capilar a través de la membrana por la anulación de los controles de instrumental quirúrgico. Usar el microscopio para ver el punto afilado de la punción capilar en la cisterna magna. CSF automáticamente debe ser dibujada en el tubo capilar una vez que la apertura ha sido perforada (Figura 2E).</li>
	<li>Dejar el tubo capilar para recoger lentamente la CSF. Si el CSF ha dejado sacar, extraer lentamente la jeringa una pequeña cantidad (~ 50 μL) para crear presión más negativa en el capilar para extraer al CSF. Nota: Como alternativa, el capilar se puede suavemente y poco a poco sacar del cerebro usando los controles del micromanipulador fina para permitir que la CSF fluya dentro del tubo capilar nuevo. Un total de ~ 10-15 μl de la CFS (~ 3-4 cm en el tubo capilar) toma ~ 10-30 min y de vez en cuando 20 μl o más pueden ser recogidos. Aunque no es absolutamente necesario, se recomienda utilizar una almohadilla de calor durante la recolección de LCR. Recolección de LCR se realizó a temperatura ambiente (~ 23 ° C).</li>
	<li>Una vez se recoge la cantidad de LCR deseado, cierre el tubo desplazando la válvula de tres vías para cerrar (para dejar de dibujar hacia fuera el líquido cefalorraquídeo).</li>
	<li>Sacar la jeringa conectada a la tubería y abra y cierre el tubo (para crear presión ecualizada en el tubo capilar, tubo y la zona exterior del tubo capilar). Vuelva a conectar la jeringa con la válvula de tres vías, pero no sumergir la jeringa.</li>
	<li>Suavemente Retire el capilar de vidrio el ratón utilizando el instrumental quirúrgico.</li>
	<li>Coloque el tubo de colección (microtubos de 1.5 mL con 1 μl de 20 x inhibidor de la proteasa) bajo el punto de afilado del vaso capilar.</li>
	<li>Abra el tubo y sumergirse suavemente la jeringa: el CSF debe fluir fuera del tubo capilar y en el tubo de la colección.</li>
	<li>Después de la recolección, centrifugar rápidamente (pulso centrifugado durante 5 s a máxima velocidad utilizando una centrífuga mini) el LCR para mezclar la muestra con el inhibidor de la proteasa en la parte inferior del tubo de colección. Nota: Las muestras CSF pueden ser alícuotas y almacena para su posterior análisis a-80 ° C. El resto del ratón puede ser disecado para otros tejidos, como cerebro y médula espinal. El ratón está todavía vivo en esta etapa y así puede también ser extraído sangre, si es necesario.</li>
</ol>

<ol><li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+Biomarkers+for+Alzheimer%27s+Disease+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Alzheimers.+Dis%22%5BJournal%5D)">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li>
<li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer%27s+disease+diagnosis%3A+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer%27s+Biomarkers+Standardization+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li>
<li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/archive/2014/302712/">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li>
<li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li>
<li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+A%CE%B242+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li>
<li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li>
<li>You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li>
<li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+amyloid-%CE%B2+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2(2013).</li>
<li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora las actuales métodos10 de recolección de LCR para minimizar la contaminación de la sangre y permitir la abundante colección de LCR (promedio ~ 10-15 μl pueden obtenerse) de ratones. Al romper la punta del capilar, la punta del tubo capilar no debe ser demasiado pequeña (como el LCR se extraerán muy lentamente) o demasiado grandes (no ser fina suficiente para recoger el LCR y tejido puede alojarse en el capilar). Debe tenerse cuidado al ...

El LCR es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. El LCR se hace principalmente de plasma de sangre, que contiene pocas células (sin glóbulos rojos y sólo unas pocas células blancas de la sangre) y está casi libre de proteínas. Es uno de los fluidos en contacto con el sistema nervioso central (SNC) y puede pasar muchos electrolitos del cerebro y la médula espinal del sistema periférico. En los seres humanos, CSF muestras se pueden recoger para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad o para fines de investigación en ensayos clínicos, como una punción raquídea (punción lumbar) es un procedimiento invasivo, menor: el líquido cefalorraquídeo puede reflejar los cambios en el SNC sin tener que acceder directamente a estos tejidos. Así, en los últimos años, para fines de investigación en la clínica, se han obtenido muestras de CSF de pacientes de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y otras demencias1,2,3. Hay muchos análisis de biomarcadores que se han desarrollado utilizando muestras de CSF para potencialmente ayudar en el diagnóstico de enfermedades en la clínica2,3. Sin embargo, hay mucho debate sobre la fiabilidad de estos ensayos para producir resultados consistentes y sensibles para diagnosticar específicamente la enfermedad4,5. Por lo tanto, hay una gran necesidad para el desarrollo de mejores ensayos y objetivos, que pueden encontrarse en el líquido cefalorraquídeo, para ayudar en la producción de una técnica estándar para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas con mayor sensibilidad y especificidad. Debido a la importancia potencial de muestras humanas de la CSF en la enfermedad, la colección del LCR de los roedores en la investigación de la neurociencia es también de interés.
Ratones son animales importantes en la investigación biológica y médica y permiten la prueba de potenciales compuestos terapéuticos y estudios de prueba de concepto antes de ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, en ratones es difícil obtener muestras CSF debido a su proximidad al cerebro en un animal pequeño, como el método de recolección de LCR en ratones es obtenerlo a través de la cisterna magna, una abertura entre el cerebelo y la superficie dorsal de la médula oblongada. Esto causa dificultad en la recolección de muestras de CSF como esta área es difícil de diseccionar a y en proximidad cercana a los vasos sanguíneos, aumentando el riesgo de contaminación de las células de la sangre. Debido a estas dificultades, la mayoría de los investigadores sólo puede obtener una pequeña cantidad de LCR para análisis (generalmente indicado como μl 5-7) y la contaminación de muestras de CSF en las células de la sangre es una preocupación primaria para análisis6,7,8 , 9. contaminación de la sangre puede ocultar resultados y no verdaderamente reflejan el estado del SNC. Además, muestra limitada recogida puede impacto investigación como en la cantidad habitual de ratones es suficiente sólo una medición (en duplicado o triplicado) usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Así, muestras CSF son agrupadas generalmente de varios ratones con el fin de tener suficiente muestra para ejecutar múltiples ensayos. Desarrollando un protocolo para la abundante, colección incontaminada de la CFS de ratones se desea grandemente y será beneficiosa en la mejora de la investigación de la neurociencia con roedores.
En el presente Protocolo, una técnica para la abundante (un promedio de 10-15 μl) colección de LCR de ratones anestesiados se describe en detalle y mejora en un método actualmente conocido de recolección de LCR para minimizar la contaminación de sangre10. Un protocolo robusto para recolección de LCR ayudará en el desarrollo de análisis de biomarcadores basados en la CSF, que podría utilizarse para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad, así como mejorar la investigación en los mecanismos que subyacen a las enfermedades que afectan el SNC.

<table><tbody><tr><td>Hidrato de cloral (utilizado como anestésico)</td><td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td><td>30037517</td><td>número CAS 302-17-0.</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>66 tecnología de visión</td><td>54002</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección curva</td><td>66 tecnología de visión</td><td>53072</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección recta</td><td>66 tecnología de visión</td><td>53070</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de ratón (con barras para las orejas)</td><td>Fabricado en la empresa.</td><td>N/A</td><td>Equipos similares disponibles en World Precision Instruments.</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Meiji Labax</td><td>Modelo 15381</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>Base magnética para micromanipulador</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments Modelo</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas (1ml)</td><td>Tansoole</td><td>02024692</td><td>Para 1ml.</td></tr><tr><td>Microtubos (1,5 ml)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Cocktail Set III Calbiochem sin EDTA</td><td></td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>A y beta humano; 42 Kit ELISA</td><td>Invitrogen</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>Tubería (tubo de teflón)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MMP-KIT</td><td>Obtenido a partir de un kit de microinyección y unido al soporte capilar y a la jeringa.</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Tiangen Biotech</td><td>OSE-MC8</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>Obtenidos de cualquier tienda/farmacia para el hogar.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

El líquido cerebroespinal (CFS) es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. Es uno de los fluidos en contacto más cercano con el sistema nervioso central y por lo tanto, se puede utilizar para analizar el estado enfermo del cerebro o la médula espinal sin acceder directamente a estos tejidos. Sin embargo, en los ratones es difícil de obtener de la cisterna magna debido a su proximidad a los vasos sanguíneos, que a menudo contaminan las muestras. El área de recolección de LCR en ratones también es difícil de diseccionar a y a menudo sólo pequeñas muestras se obtienen (máximo de 5-7 μl o menos). Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora en los métodos actuales de colección para minimizar la contaminación de la sangre y permiten la abundante colección de LCR (en promedio que 10-15 μl se pueden recoger). Esta técnica puede utilizarse con otros métodos de disección para la colección de tejidos de ratones, como no afecta ninguna tejidos durante la extracción de la CSF. Así, el cerebro y la médula espinal no se ven afectadas con esta técnica y permanecen intactos. Con pureza y una mayor recolección de muestra de LCR, análisis más pueden utilizarse con esta investigación de la neurociencia de líquido para más ayuda y entienden mejor las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Utilizando el procedimiento descrito aquí (figura 1 y figura 2), el CSF recogido inmediatamente en el tubo capilar debe ser claro (Figura 2E), no color de rosa o rojo. Si hay un color de rosa a la tonalidad rojiza al líquido en el capilar, luego hubo contaminación con sangre.
Como un ejemplo de la aplicación de la muestra de LCR obtenidas c...

Este protocolo describe una técnica mejorada para la abundante colección de líquido cefalorraquídeo (LCR) sin contaminación de la sangre. Con la mayor colección de la muestra y la pureza, se pueden realizar análisis más uso de CSF para mejorar nuestra comprensión de las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la recolección de líquido cefalorraquídeo de ratones sin contaminación por sangre. Este método proporciona una forma fácil y fiable de recolectar LCR para monitorear los biomarcadores de enfermedades neuronales. La principal ventaja de esta técnica es que la adición con el micromanipulador para ayudar en la recolección de LCR de ratones disminuye la contaminación de la sangre durante la recolección.Comience colocando un capilar de vidrio tirado en un soporte capilar que está firmemente montado en un micromanipulador. A continuación, mientras observa a través de un microscopio de disección, use pinzas rectas para romper la punta del capilar afilado de modo que el diámetro interior de la punta rota sea de aproximadamente 10 a 20 micras. A continuación, conecte un tubo delgado y una jeringa al otro extremo del soporte capilar, conecte el tubo delgado y la jeringa con una válvula de tres vías y cambie la válvula de tres vías para abrirla.A continuación, sumerja la jeringa para expulsar cualquier contaminante y crear una presión positiva en el tubo capilar. Repita esto varias veces desconectando y volviendo a conectar la jeringa a la válvula de tres vías. A continuación, aspire aire de 100 a 200 microlitros antes de la reconexión final de la jeringa con la válvula de tres vías.Mueva el micromanipulador con el capilar de vidrio hacia un lado para evitar daños durante el procedimiento quirúrgico. Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que el ratón haya sido completamente anestesiado pellizcando las cuatro extremidades y observando la ausencia de una reacción. Luego, use tijeras de disección para cortar y recortar el cabello en la parte posterior de la cabeza del ratón desde arriba de los ojos entre las orejas hasta la parte inferior del cuello.Asegure la cabeza del ratón con un adaptador de ratón de marco estereotáxico. Asegúrese de que la cabeza no se pueda mover y esté firmemente asegurada en el adaptador empujando suavemente hacia abajo la cabeza del mouse. Use tijeras y pinzas curvas para cortar la piel del ratón, a través de la parte posterior del cuello y luego por la mitad del cráneo, entre las orejas y los ojos del ratón.Separe la piel y el tejido y sáquelos del área sobre la cisterna magna. Mientras observa a través del microscopio de disección, diseccione cuidadosamente las últimas capas delgadas de músculo sobre la base del cráneo con fórceps y mueva estas capas de músculo hacia un lado y fuera del área de interés. Una vez que la duramadre sobre la cisterna magna esté expuesta, use un bastoncillo de algodón húmedo para limpiar la membrana y luego use un bastoncillo de algodón seco para secar el área.La cisterna magna parece triangular con uno o dos grandes vasos sanguíneos que atraviesan el área. Cualquiera de los lados o entre los vasos sanguíneos es óptimo para la inserción capilar y la recolección de líquido cefalorraquídeo. Una vez que la cisterna magna esté expuesta, use el micromanipulador para alinear el capilar de vidrio con la parte posterior de la cabeza del mouse de modo que la punta afilada esté justo detrás de la membrana en un ángulo de 30 a 45 grados.A continuación, sumerja la jeringa una o varias veces y luego mueva el émbolo hacia atrás de 100 a 200 microlitros para asegurarse de que no haya contaminantes y que haya presión negativa en el capilar de vidrio. A continuación, acerque la punta capilar a la membrana hasta que se pueda ver la resistencia, pero sin perforar la membrana. Golpee los controles del micromanipulador para golpear suavemente el tubo capilar a través de la membrana.El líquido cefalorraquídeo debe introducirse automáticamente en el tubo capilar una vez que se ha perforado la abertura. Deje el capilar en su lugar para recoger lentamente el líquido cefalorraquídeo. Si el líquido cefalorraquídeo ha dejado de fluir, extraiga lentamente la jeringa aproximadamente 50 microlitros para crear más presión negativa en el capilar.Se recolectan de diez a 15 microlitros de líquido cefalorraquídeo en 10 a 30 minutos. Una vez que se haya recogido el volumen deseado de líquido cefalorraquídeo, cierre el tubo desplazando la válvula de tres vías para cerrar y retirar la jeringa conectada al tubo. Abra y luego cierre el tubo para crear una presión igualada en el capilar, el tubo y el área fuera del capilar.A continuación, vuelva a conectar la jeringa antes de retirar suavemente el capilar de vidrio del ratón con un micromanipulador. A continuación, coloque el tubo de recolección que contiene un microlitro de inhibidor de la proteasa 20X debajo de la punta afilada del capilar de vidrio. Abra el tubo y sumerja suavemente la jeringa.El líquido cefalorraquídeo debe salir del capilar y entrar en el tubo de recolección. Después de la recolección, centrifugue el LCR por pulsos para mezclar la muestra con el inhibidor de la proteasa en el fondo del tubo de recolección. Las muestras de LCR se pueden alícuota y luego almacenar para su posterior análisis a menos 80 grados Celsius.El líquido cefalorraquídeo recogido de ratones APP/PS1 demostró un aumento significativo en los niveles de A beta 42 humano a los 12 meses de edad. En ratones de tipo salvaje, no se detectó ningún A beta 42 humano. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en una hora si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar los vasos sanguíneos al insertar el capilar y solo hacer ajustes menores con el micromanipulador durante la recolección del líquido cefalorraquídeo para evitar la contaminación con sangre.

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Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el cambio CSF ​​conforme progresa la enfermedad en pacientes humanos. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de LCR de serie del ratón.

Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

Fuente: Sweeney, A. M., et al. Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo a través del cráneo de ratón intacto mediante macroscopía de fluorescencia. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el proceso de visualización del flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en un cerebro de ratón mediante imágenes de fluorescencia. Se inyecta un marcador fluorescente en la cisterna magna (CM), lo que permite rastrear su movimiento con LCR a través de los espacios subaracnoideos y...

Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo en un cerebro de ratón mediante macroscopía de fluorescencia

El líquido ventricular cefalorraquídeo (LCR) baña las células de la corteza cerebral y neuroepitelial progenitoras durante el desarrollo temprano del cerebro del embrión. Aquí se describe el método desarrollado para aislar CSF ventricular de embriones de roedores de diferentes edades con el fin de investigar su función biológica. Además, demostramos nuestra disección cerebral cortical explantes y técnica de cultivo que permita el crecimiento de explantes con volúmenes mínimos de medio de...

Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

Aquí se describe un protocolo para realizar la canulación de cisterna magna (CMc), una forma mínimamente invasiva para ofrecer marcadores, sustratos y moléculas de señalización en el líquido cerebroespinal (CFS). Combinado con diferentes modalidades de imágenes, CMc permite sistema de glymphatic y evaluación dinámica de CSF, así como entrega de todo el cerebro de varios compuestos.

Implantación de la cánula en la Cisterna Magna de roedores

Las imágenes ópticas transcraneales permiten imágenes de campo amplio del transporte de líquido cefalorraquídeo en la corteza de ratones vivos a través de un cráneo intacto.

En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Este artículo describe un protocolo detallado para aumentar la concentración de glucosa en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de ratones. Este enfoque puede ser útil para estudiar los efectos de la glucosa alta en LCR en la neurodegeneración, la cognición y el metabolismo periférico de la glucosa en ratones.

Implantación de minibomba osmótica para aumentar la concentración de glucosa en líquido cefalorraquídeo de ratón

El protocolo muestra repetidas recolecciones de líquido cefalorraquídeo y sangre de ratas epilépticas realizadas en paralelo con un monitoreo continuo de video-electroencefalograma (EEG). Estos son fundamentales para explorar posibles vínculos entre los cambios en varias moléculas de fluidos corporales y la actividad convulsiva.

Toma de muestras de líquido cefalorraquídeo y sangre de la vena lateral de la cola en ratas durante los registros de EEG

Para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral in vivo, los métodos farmacológicos tradicionales son invasivos, a menudo dañando el cráneo, la duramadre y las leptomeninges. En este trabajo, desarrollamos una técnica mínimamente invasiva que combina la inyección de magna intracisternal (ICM) guiada por nanoinyectores con imágenes de contraste de moteado láser, preservando la integridad del cráneo y las leptomeninges.

Ensayo emparejado de nanoinyección de cisterna magna y contraste de moteado láser para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral in vivo

Aquí se presenta un protocolo para evaluar los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de ratón, que desempeñan un papel importante en múltiples enfermedades neurológicas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método integrado que permita tanto la evaluación funcional del drenaje de trazadores como la caracterización morfológica detallada de la red de MLVs dorsales.

Protocolo integrado para la evaluación de linfáticos meníngeos: inyección de cisterna magna, imagen de ganglios linfáticos, disección meníngea y tinción de montaje completo

Aprenda un método mejorado para recolectar líquido cefalorraquídeo en ratones anestesiados utilizando un micromanipulador. Esta técnica minimiza la contaminación sanguínea y permite obtener muestras puras para el análisis de biomarcadores en enfermedades neurológicas.

Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

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