Name: Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a realizar microinyecciones en embriones de Nasonia vitripennis para facilitar modificaciones genómicas hereditarias. Este método permite manipular directamente el genoma de la avispa y avanzar en investigaciones sobre biología del veneno y determinación del sexo.

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Este trabajo fue apoyado por un generoso Universidad de California, Riverside (UCR) laboratorio puesta en marcha fondo O.S.A, Instituto Nacional de alimentos de USDA y proyecto agricultura (NIFA) Portilla (1009509) de O.A.

1. N. Vitripennis Colonia cría
<ol>
	<li>Establecer varias colonias (~ 3-5) mediante la colocación de 200-500 N. vitripennis adultos (con una relación 3:1 hembra: macho) en jaulas compartidas de errores. Nota: Alternativa al uso de dormitorios de error, las avispas también puede ser propagado en múltiples, tubos de ensayo de vidrio tapados con algodón con aproximadamente 15-20 avispas/vial.<ol>
		<li>Mantener las avispas a 25 ± 1 ° C con humedad relativa de 30% y un 12:12 luz oscura ciclo de alimentarlo cada día con pequeñas gotitas de 1:10 (v/v) solución de sacarosa y agua. Nota: Propagación de las colonias de avispas y colecciones puede también realizarse a temperatura ambiente sin humedad controlada; sin embargo, las temperaturas inferiores a 25 ° C bajará un poco el momento del desarrollo de los embriones.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Permiten a las avispas para aparearse durante al menos 4 días antes de las inyecciones.<ol>
		<li>Durante los primeros dos días, permitir que las hembras acopladas a la alimentación en fresco S. modificaba pupas, así como pequeñas gotitas de un 1:10 (v/v) solución de sacarosa y agua.</li>
		<li>Para los siguientes dos días, retire las pupas de moscas de carne para privar a las avispas hembra de un sitio de oviposición, haciéndolos muy grávida.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. recogida y alineación de embriones en fase de pre-blastoderm N. Vitripennis
<ol>
	<li>Permitir que las avispas que parasitan (ovipositan embriones) en jóvenes anfitriones (pupas deS. sellada ). Para mantener fresca el hosts, almacenar hosts en 4 ° C inmediatamente después de la obtención y sólo quitarlo cuando sea necesario. Nota: Jóvenes anfitriones pueden determinarse con una mosca de color rojo mientras que más viejos anfitriones tienen un pupario de color más oscuro (figura 1A).<ol>
		<li>Lugar fresco individual S. modificaba pupas en un tapón de espuma con un hueco del tamaño de pupas a cortar el centro. Exponer sólo ~ 0,2 cm del extremo anterior (sitio recomendado: oviposición) del host para la máxima concentración de parasitismo y la colección embrionaria más fácil. Nota: El extremo anterior es redondeado, mientras que el extremo posterior es más grueso y contiene una 'cráter-como' apertura (figura 1B).</li>
		<li>Colocar pupas de host (aproximadamente 5 pupas de host por 100 avispas) en este arreglo en la caja y espere aproximadamente 45 minutos para permitir que las avispas que parasitan (figura 2- ii). Nota: Es muy importante que los embriones son tan jóvenes como sea posible, idealmente en la primera hora de ser ovipositaron, para asegurarse de que están en la etapa de pre-blastoderm. Viejos embriones (&#62; 1,5 h) no se debe inyectar.</li>
		<li>Quitar hosts parasitados por recuperarlos a mano y suavemente cepillado/vuele cualquier avispas que reside. Reemplazarlos con los anfitriones frescos después de cada ~ 15 minutos para continuar recogiendo temprano en escena huevos durante las inyecciones.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Retire las huestes recién parasitadas de jaula a mano. Con un microscopio de disección, con unas pinzas, con cuidado retire el extremo posterior (0,4 cm) del pupario exterior (cáscara de la pupa) para exponer los huevos de N. vitripennis (figura 2- iii). Nota: Debe tenerse cuidado para evitar pinchar la piel pupal; Si esto sucede, la hemolinfa humedezca los embriones de la avispa, que serán muy difíciles de quitar para la microinyección.</li>
	<li>Usar pegamento líquido para pegar un cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio limpio para preparar una diapositiva de alineación del embrión (figura 3). Nota: Se utiliza un adhesivo instantáneo de alto rendimiento para aumentar la fuerza y velocidad de sequía, sin embargo cualquier pegamento que puede mantener el cubreobjetos de la mudanza de la diapositiva es aceptable.</li>
	<li>Sacando los embriones desde el host cuidadosamente con un pincel de punta fina mojado, asegurándose de no dañar la piel suave de la pupa del huésped. Nota: una ' selección de embriones,' que es esencialmente un medio de un par de pinzas ultrafinos, puede utilizarse en lugar de un pincel.</li>
	<li>Transferencia de ~ 20 embriones uno por uno en la diapositiva, inmediatamente adyacente al lado del cubreobjetos con un pincel húmedo. Oriente el extremo anterior del embrión contra el borde de la cubierta de la diapositiva de manera que el extremo posterior de los embriones se apunta en la misma dirección (figura 2- iv). Esto permitirá una mayor precisión de inyección en la misma posición entre todos los embriones. Nota: Esta técnica mejorada requiere cinta adhesiva doble cara para fijar los embriones a la diapositiva como se describió anteriormente21,22. Además, desecar los embriones, ni cubrir los huevos con el aceite de halocarburos durante la inyección tal como se describe anteriormente para el N. vitripennis embrión microinyección22.</li>
</ol>
3. la aguja de preparación de microinyecciones
<ol>
	<li>Coloque un vidrio de aluminosilicato capilar en un extractor de aguja. Nota: Una buena aguja es crítica para el éxito N. vitripennis inyecciones de embriones. Las agujas de inyección deben tener un agudo y punta fina para permitir la fácil penetración a través del corion. Cuarzo y borosilicate capilares agujas también pueden ser utilizado (figura 4).</li>
	<li>Establecer el calor 605, la velocidad a 130, el retraso a 80, la Tire a 70 y la presión a 500 en un extractor de aguja. Nota: Configuración del extractor de aguja adicional para tirar agujas de borosilicato y cuarzo puede verse en la tabla 1; los parámetros pueden variar de filamentos y tiradores diferentes.</li>
	<li>Activar el botón de la aguja para crear la aguja correcta. Repita según sea necesario para la producción de múltiples agujas. Nota: Agujas tiradas pueden guardarse colocándolos en una placa de Petri que contiene un que paralelo varios rollos de arcilla de modeler comercial.</li>
	<li>Bisel de la punta de la aguja ligeramente tocando la punta de la placa abrasivos de diamante alrededor de 10 s a 25 ° C (figura 2- iii). Nota: Las agujas de inyección aprovechar biselado por promover la entrada en los embriones con un daño mínimo al tiempo que simultáneamente mejora el flujo de regentes a través de la aguja.</li>
</ol>
4. embrión microinyección
<ol>
	<li>Prepare la mezcla de inyección consistente en reactivos de modificación del genoma (por ejemplo, transposón + ayudante transposasa, o reactivos CRIPSR, etcetera) y mantenerlo en hielo.</li>
	<li>Cargar la aguja de inyección con 2 μl de mezcla de inyección mediante consejos de microloader. Nota: La mezcla de inyección demostrada en el protocolo consiste en Guía de solo RNA (sgRNA) (s) y la proteína recombinante Cas9 mezclado en H2O.</li>
	<li>Colocar el portaobjetos de vidrio con los embriones alineados en el escenario de un microscopio compuesto.</li>
	<li>Introduzca cuidadosamente la aguja en el extremo posterior del embrión con un ángulo vertical de 25-35 °.</li></ol>Inyectar 1-5 pL de mezcla de inyección (2-10% aproximadamente del volumen del embrión) y asegúrese de que el embrión parece hincharse un poco, la mezcla se inyecta en ella (figura 2- iv). Nota: Si se inyecta demasiada mezcla de inyección en el embrión puede reventar disipando el citoplasma del embrión. Además, mal biselado o roto demasiado grande de agujas con una apertura también puede causar ruptura del embrión.<ol>
		<li>Intente volver a biselado agujas si obstrucción ocurre. El citoplasma de embriones N. vitripennis es inusualmente viscosa y pegajosa, que conduce a la aguja frecuente obstrucción (inyecciones de 1/25). Nota: Es importante mantener los embriones húmedos durante el período de inyección añadiendo regularmente agua desionizada utilizando el pincel. La cantidad de agua en el pincel es clave para moverse embriones y alinear con facilidad. Demasiada agua los resultados en embriones de agua flotante y poco hace difícil moverse.</li>
		<li>Inyecte ~ 20-40 huevos en un momento (debe tomar aproximadamente 10 minutos), luego se detiene. Transferir los huevos inyectados con un pincel mojado tocando ligeramente los huevos inyectados y colocarlos en un host. Luego continuar inyectando con una fresca recién puesta de huevos (&#62; 1 h de edad). Nota: Idealmente este protocolo es más efectivo si una persona es continuamente recogiendo y alineación de huevos, mientras que otra persona es inyectar los componentes de modificación del genoma y transplante de embriones inyectados a pupas de host.</li>
	</ol>
	

5. trasplante inyectado G0 N. vitripennis embriones en Host Pre-stung
<ol>
	<li>Coloque cuidadosamente los embriones inyectados de0 G en un previamente picado S. modificaba pupas (figura 2- vi) con un pincel mojado después de la microinyección. Nota: Las pupas de host utilizadas para recolectar embriones de microinyección trabajará para ello. También, a pesar de un esfuerzo importante, actualmente no hay disponible dieta artificial que puede ser utilizado22.<ol>
		<li>Coloque los embriones inyectados hasta 40 uno en un momento en un único host previamente picado para evitar hacinamiento y larvas de la competencia. Nota: La inyección puede causar daños a los embriones; descuidado trasplante de embriones inyectados a las pupas de host puede apretar la yema hacia fuera o el componente inyectado y conducen a la muerte de los embriones.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Colocar las pupas de host en una placa de Petri con papel filtro húmedo y bolas de algodón e incúbelos a 25 ° C con aproximadamente 70% de humedad hasta inyectados embriones eclosionan (aproximadamente 1-2 días) (figura 2- vii). Nota: Importante, los hosts pueden dejarse con un pelado pupario y N. vitripennis huevos se desarrollan normalmente hasta se incuban en una cámara humidificada (placa de Petri con papel filtro húmedo y bolas de algodón) para evitar la desecación. Incubar a temperatura ambiente y con la humedad de las bolas de algodón humedecido es suficiente en caso de que no se puede controlar la humedad.</li>
	<li>Transferencia las pupas de anfitrión en una nueva placa de Petri en el 70% de humedad y 25°C después de portilla de embriones0 G.<ol>
		<li>Monitorizar el host pupas y larvas de0 G inyectadas diariamente. Si las pupas de host tienen un olor fétido, transferir las larvas inyectadas a nuevas pupas huésped sano.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. detección de modificaciones del genoma
<ol>
	<li>Eliminar cada N. vitripennis pupas del host usando un pincel fino o selección de embriones. Larvas de0 G inyectadas deben pupate alrededor de 8 días después de la inyección.</li>
	<li>Lugar cada pupa quitado en un frasco de cristal aislado tapados con algodón y permitir que emergen como adultos de0 G, garantizando que las hembras nacidas sea virgen que ayudarán con cruces genéticos posteriores. Nota: Las hembras pueden ordenarse de machos por la longitud del ala: las hembras tienen alas más largas que se extienden más allá del perfil del cuerpo cuando está en el lado. Todos pupas hembras microinyectados pueden juntarse en un frasco tapado, y lo mismo se aplica a pupas masculinas.</li>
	<li>Individuos de pantalla G0 , después de la eclosión, o PCR o visualmente (si interrumpir un gen fenotípico). Por ejemplo, si CRISPR se utiliza para crear eliminaciones en un determinado gen y el gen interrumpido confiere un fenotipo visible, luego ordenar y mantener a las personas con una versión mutante del fenotipo afectado (figura 2- viii)21. Si, sin embargo, el gen afectado codifica para un fenotipo no visibles, como una mutante de un gen esencial, realizar un esquema de cruce (cross G0 macho con hembra de tipo salvaje o Cruz G0 hembra con macho tipo salvaje) para recuperar y pantalla para mutantes hereditarios a través de análisis de la letalidad o esterilidad. Nota: Similar a la D. melanogaster, N. vitripennis adultos puede ser inmovilizado por la exposición a CO2 lo que permite la manipulación directa. Por otra parte, las hembras fecundadas dará lugar a crías macho haploide del 100%, por lo tanto, que una hembra fecundada mutante puede dar lugar a gran número de hombres mutantes que pueden utilizarse para el análisis posterior. Nota: Las mutaciones en genes esenciales debe ser guardado por el apareamiento sobreviviente G0 inyectado hembras (presumiblemente heterozigótico para una mutación) a hombres de tipo salvaje; en este caso, la mitad de la progenie masculina de1 G debe morir debido a la herencia de la mutación letal, mientras que la mitad de la progenie hembra G1 serán portadores de la mortal.</li>
	<li>Outcross G0 adultos y progenie de1 pantalla G para inserciones de transgenes mediante transgénesis marcadores si el objetivo es la transgénesis. Actualmente transgénesis queda demostrada en el N. vitripennis.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La reciente secuenciación del genoma N. vitripennis ha desatado una importante necesidad de herramientas moleculares caracterizar funcionalmente genes desconocidos dentro de esta especie23. El sistema CRISPR Cas9 y muchos otros genes herramientas de edición, han demostrado para ser valiosos en la investigación de las funciones del gene para un número de organismos24. Sin embargo, para generar mutaciones heredables, estas herramientas requieren realizar microinyecciones de embrión. Por lo tanto, demostrado aquí es una técnica visual detallada que incluye una serie de innovaciones que permitan la eficiente N. vitripennis microinyecciones de embrión.
En general, esta técnica detallada ofrece una serie de innovaciones importantes, con respecto a los métodos existentes23, que permiten eficiente N. vitripennis microinyecciones de embrión. Por ejemplo, para facilitar la rápida recolección de embriones, una herramienta de oviposición (tapón de espuma) es creada y utilizada para restringir la postura totalmente al extremo posterior del huésped (figura 1), que facilita enormemente la colección de numerosos embriones dentro de un corto período de tiempo. Técnicas para la cría de las colonias de avispas con un gran número para recoger el mayor número de huevos también mejoradas y definidas. Además, para acelerar la alineación del embrión, se desarrolla un dispositivo de alineación de embriones que permite embriones ser alineados e inyectado sin tener que utilizar cinta adhesiva doble cara para garantizar los embriones en el lugar (figura 3).
Además, se encuentra que al mantener los embriones húmedos con agua durante la inyección y no desecación los embriones o cubriéndolos con aceite mejorado las tasas de supervivencia. Además, varios tipos de vidrio capilar se prueban y se determinan parámetros para construir el perfectas agujas para microinyección N. vitripennis (tabla 1, figura 4). Por otra parte, microinyección siguiente, supervivencia embrionaria tarifas son capaces de aumentar considerablemente debido a incubar huevos inyectados en huéspedes previamente picados colocados en cámaras de alta humedad (70%). Estas innovaciones permiten un procedimiento más ágil y acertado de microinyección para N. vitripennis.
Pequeñas modificaciones en cuanto a aparatos de inyección y procedimientos de cría se pueden hacer en el presente Protocolo, dependiendo de las preferencias del usuario. Sin embargo, una serie de pasos críticos será esencial para generar con éxito mutantes en N. vitripennis. Por ejemplo, trabajando rápidamente para que los embriones inyectados son &#62; 1 h old y asegurando que agujas de inyección están suficientemente afiladas minimizar el daño al embrión ambos serán esenciales. Si bien este protocolo debe ser eficaz para la generación de mutaciones en los genes de muchos (si no todos), una limitación importante es el requisito de CRIPSR/Cas9 dirigir una secuencia de PAM (NGG) que determinará la secuencia de destino.
En conclusión, esta técnica mejorada puede utilizarse para generar muchos tipos de modificaciones del genoma, tales como mutaciones, canceladuras y posiblemente incluso inserciones usando tecnologías CRIPSR/Cas921o incluso transgénica inserciones para generar transgénicos N. vitripennis, que debe aceleran investigación funcional en este organismo.

La avispa joya, N. vitripennis, es una de las cuatro especies dentro del género Nasonia que son ectoparasitoides de carne comer moscas como Sarcophaga sellada1. Debido a sus períodos generacional rápido, facilidad de cría en el laboratorio y una gama de atributos biológicos únicos e importantes, N. vitripennis ha sido un foco para el desarrollo de múltiples herramientas experimentales en organismos modelo tradicional . Por ejemplo, algunos atributos biológicos únicos incluyen un sistema de reproducción de haplo-diploide2, una relación con parásitos microbiana y genética3,4y un supernumerario (B) cromosoma5,6 ,7. Tomados juntos, estos hacen N. vitripennis un importante sistema experimental para experimentos destinados a dilucidar los aspectos celulares y moleculares de estos procesos, además de otras como veneno producción8, 9, de10,de determinación de sexo11y evolución y desarrollo del eje patrón formación12,13,14. Además, el kit de herramientas genética para el estudio de la biología de N. vitripennis ha aumentado dramáticamente en la última década o así, con la secuenciación de un genoma de alta resolución15, varios genes estudios16,17,18y el capacidad de alterar funcionalmente genes depender de ARN de interferencia (ARNi)19,20, que juntos han mejorado las capacidades de realizar genética reversa en este organismo y maleabilidad.
A pesar de los muchos importantes los avances científicos y herramientas ampliado en este organismo, a partir del conocimiento presente sólo un grupo ha realizado con éxito microinyecciones embrionarias para generar el genoma hereditario modificaciones21. Esto es principalmente debido a las dificultades de trabajar con embriones de N. vitripennis , ya que son bastante frágiles y pequeñas, siendo ~2/3 el tamaño de los embriones de Drosophila melanogaster , que generalmente dificulta manipular. Además, N. vitripennis hembras depositan sus huevos en las pupas de moscas de carne previamente picado, dentro de la cual la totalidad de la embriogénesis, larval y el desarrollo pupal ocurre. Por lo tanto, para microinjertos exitosos, blastoderm previa etapa, embriones deben ser eficientemente recogidos en pupas de host, rápidamente microinyectados y se trasplanta inmediatamente hacia sus anfitriones para el desarrollo. Estos pasos requieren precisión y destreza para evitar dañar los embriones microinyectados, los anfitriones pupas, haciendo la técnica excepcionalmente difícil. No obstante, existe un protocolo corto publicado hace más de una década que describe N. vitripennis embrión microinyección22. Sin embargo, este procedimiento requiere que se secan por los embriones recién puestos, utiliza cinta adhesiva para la fijación de los huevos para microinyección y no incluye una demostración de la técnica. Por lo tanto, se describe aquí es un protocolo actualizado y revisado, incluyendo un procedimiento visual, detallando un mejor protocolo paso a paso para N. vitripennis microinyecciones de embriones que pueden ser seguidos por cualquier laboratorio básico para generar el genoma hereditario modificaciones en este insecto modelo importante.

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td><td>Jaula de cría</td></tr> de <tr><td>insectos Tubos de ensayo de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>Pupas de mosca de la carne, Sarcophaga bullata</td><td>Carolina Insects</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>Biseladora de microelectrodos</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>Placa abrasiva de diamante (tamaños de punta de 0,7u a 2,0u)</td><td>Sutter Instrumentos</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kite R</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector programable Femtojet Express</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>Microscopio estereoscópico P-1000 o P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio compuesto</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio de aluminosilicato 1 mm (diámetro exterior) X 0,58 mm (diámetro interior)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>También puede utilizar Orosilicato o Cuarzo</td></tr><tr><td>Identi-Tapones</td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>Tapones de espuma</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover glass</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>Para pegar cubreobjetos en el portaobjetos del microscopio</td></tr><tr><td>Pincel de punta fina</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de punta ultrafina</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Puntas de microcargador</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de nasonia vitripennis

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

La avispa joya Nasonia vitripennis ha surgido como un sistema modelo eficaz para el estudio de procesos incluyendo la determinación del sexo determinación sexual haplo-diploide, síntesis del veneno y las interacciones huésped-simbionte, entre otros. Una limitación importante de trabajar con este organismo es la falta de protocolos efectivos para llevar a cabo la modificación dirigida del genoma. Una parte importante de la modificación del genoma es la entrega de reactivos, incluyendo las moléculas CRISPR/Cas9, en embriones mediante microinyección de edición. Si bien microinyección está bien establecido en muchos organismos modelo, esta técnica es particularmente desafiante para llevar a cabo en N. vitripennis principalmente debido a su tamaño pequeño embrión y el hecho de que el desarrollo embrionario ocurre enteramente dentro un pupa pupa parasitada. El siguiente procedimiento supera estos retos importantes y demostrando un procedimiento ágil y visual para efectivamente eliminar embriones avispa de parasitados pupas host, microinjecting, cuidadosamente trasplantarlos de nuevo en el host para la continuación y finalización del desarrollo. Este protocolo fuertemente mejorará la capacidad de grupos de investigación para llevar a cabo modificaciones avanzadas del genoma de este organismo.

Este protocolo proporciona directrices detalladas para la colonia de cría, colección pre-blastoderm embrión, alineación, microinyección y posterior trasplante después de la inyección y puede ser utilizado para la ingeniería del genoma eficiente en N. vitripennis. Como se muestra en la figura 2, la secuencia general de pasos para una exitosa microinyección en N. vitripennis incluyen: (i) permitir que adultos machos y hembras para aparearse (~ 4 días), (ii) suministro de pupas de mosca fresca host (S. modificaba) colocado en un tapón de espuma modificado a hembras fecundadas y permitiendo para la oviposición (~ 45 min), (iii) cuidadosamente pelando lejos la cutícula de pupas parasitadas host para exponer y recoger embriones en fase de pre-blastoderm de avispa (~ 15 min), (iv) alinear recogida embriones (~ 15 min), (v) microinjecting componentes de modificación del genoma en embriones (~ 15 min), cuidadosamente colocando embriones inyectados (vi) de nuevo en picado previamente hosts para permitir el correcto desarrollo (~ 15 min), y (vii) prevención de la deshidratación del embrión inyectado/host mediante la transferencia de en una cámara humidificada con aproximadamente 70% de humedad relativa (~ 15 min). Huéspedes parasitados luego se incuban durante aproximadamente 14 días permitir el desarrollo completo de N. vitripennis embriones. Una vez inyectado, adultos emergen desde el host (viii), aislaran, mate y les pantalla individualmente la presencia de mutaciones esperadas.
Para la penetración de la aguja efectiva y microinyección en embriones de N. vitripennis , se prueban varios tipos de agujas de capilar de vidrio con filamento incluyendo tipos de cuarzo, silicato y borosilicato. Se encuentra que la calidad de la aguja es crítica para evitar la rotura/taponamiento durante la inyección y para lograr altas tasas de ambos eficacia de supervivencia y transformación del embrión. Para cada tipo de vidrio, se desarrolló un protocolo eficaz para sacar las agujas para poder tener una deseado hipodérmica larga punta en forma eficaz para microinyección de embriones de N. vitripennis usando tiradores de diferentes Micropipetas (P-1000 y P-2000) (tabla 1 Figura 4).
Para optimizar el procedimiento, las tasas de supervivencia se miden después de la inyección de cantidades variables de componentes de modificación del genoma. Los componentes de modificación genoma utilizados aquí eran mixto guía RNAs y proteínas Cas9 para genoma mediada por CRISPR edición, que se demuestre previamente que funcionan bien en N. vitripennis21. Similar a lo que antes era divulgado aquí un sgRNA dirigidos al gene de cinabrio está diseñado y sintetizado. Por orientación e interrumpir este gen, se ve un cambio fenotípico fácilmente identificable en el color de los ojos del organismo19,21. Una mezcla de inyección combinando una variedad de concentraciones de sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 y 320 ng/μL) con Cas9 proteína (0, 20, 40, 80, 160 y 320 ng/μL) se crea y se inyectan en embriones de tipo salvaje N. vitripennis. La tasa de supervivencia de los embriones inyectados es encontrada para ser dependiente de la dosis (tabla 2)21. La concentración creciente del sgRNA y Cas9 proteína a las tasas de disminución de la supervivencia (tabla 2), quizás debido a efectos off-target aditivos. Humedad alta (~ 70%) se encuentra también a ser importante para la supervivencia de embriones después del trasplante a los anfitriones, como humedad baja (~ 10%) resultaron en la muerte de 100% a todos los embriones inyectados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
Figura 1 . Preparación de pupas de host (S. modificaba) para N. vitripennis oviposición embrión. (A) Joven y viejo pupas de S. modificaba . Pupas de mayores tienen una cutícula más oscuro mientras que pupas más jóvenes tienen un tinte más rojizo a su cutícula. Pupas jóvenes son preferidos para maximizar la oviposición. Extremos anteriores y posteriores de las pupas se pueden distinguir también por un "cráter-como apertura en el extremo posterior, mientras que el extremo anterior llega a un punto redondeado. (B) preparación de pupa de Host (S. sellada) para la oviposición de embrión N. vitripennis . Insertando un tapón de espuma que ha tenido un pupas de las pupas de host tamaño agujero tallado hacia fuera. Tienen la parte posterior de la cara de pupas de host dentro del enchufe mientras que 0,2 cm del extremo anterior descubierto para permitir la máxima concentración de oviposición en el área anterior. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
Figura 2 . Línea de tiempo para la creación de N. vitripennis mutantes por microinyección. Cronología de la colección de embriones N. vitripennis , CRISPR/Cas9 microinyección y procedimientos después de la inyección. Adultos de N. vitripennis podían aparearse en ausencia de un sitio de oviposición durante 4 días (). Después, un fresco, mosca de la carne host pupas, S. sellada, dentro de un tapón de espuma en cuanto a exponer sólo 0,5 cm del extremo posterior, se introdujo a las hembras grávidas por 45 min para permitir el parasitismo (ii). Al mismo tiempo materiales de inyección incluyendo agujas de microinyección y CRISPR/Cas9 componentes prepararon (iii). Los embriones fueron recogidos desde el host (iv), alineados (v) e inyectó CRISPR/Cas9 componentes (vi). Los embriones inyectados con cuidado se transfiere nuevamente a un host previamente picado (vii) y se incubaron hasta completamente desarrollados (14 días) (viii). Cuando los adultos emergieron, mutantes fueron defendidos para fenotipos esperados CRISPR/Cas9 inducida por mutaciones en el gene de la blanco (ix). El procedimiento completo generalmente toma 19 días para terminar. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
Figura 3 . Portaobjetos de microscopio modificado para el revestimiento de los embriones. (A) A cubreobjetos. (B) una diapositiva del microscopio. (C) un dispositivo de alineación de embrión.Puede pegar un cubreobjetos sobre un portaobjetos de microscopio a utilizar a los embriones de línea para la inyección. El propósito del cubreobjetos es actuar como un borde para permitir la fácil manipulación y guarnición de los embriones. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
Figura 4 . Preparación de la aguja de inyección. (A) ejemplos de agujas de vidrio de aluminosilicato buenos y malos. (B) la punta de una aguja biselada unbeveled correctamente biselada y mal. Tubos capilares de vidrio de aluminosilicato fueron tirados usando un extractor de la micropipeta. Las puntas de aguja producido fueron entonces abrieron suavemente y refinaron con un beveler. La aguja biselada buena tiene una punta muy afilada, y la aguja biselada mala tiene una punta Roma. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tipo de capilar de vidrio</td>
			<td>Modelo de extractor de aguja de Sutter</td>
			<td>Calor</td>
			<td>Filamento</td>
			<td>Velocidad</td>
			<td>Retardo de</td>
			<td>Tire de</td>
			<td>Presión</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuarzo</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicato de</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicato</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Configuración para extractor de aguja. Nota: Ajuste de aguja puller variar de máquina a máquina por lo que cada laboratorio tendrá que optimizar sus propios ajustes de extractor de aguja. Esta tabla ha sido modificada de Li et al. 21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">Total embriones</td>
			<td>Trasplante (10% humedad)</td>
			<td colspan="4">Trasplante (70% humedad)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las larvas sobrevivientes</td>
			<td>Las larvas sobrevivientes</td>
			<td colspan="3">Adultos sobrevivientes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total (%)</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ninguna inyección</td>
			<td>Ninguna inyección</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua</td>
			<td>Agua</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/μl</td>
			<td>20 ng/μl</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng/μl</td>
			<td>40 ng/μl</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng/μl</td>
			<td>80 ng/μl</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng/μl</td>
			<td>160 ng/μl</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng/μl</td>
			<td>320 ng/μl</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2. Tipos de inyección y trasplante supervivencia y mutagénesis basados en inyecciones de diferentes concentraciones de sgRNA y Cas9. Esta tabla se ha modificado de Li et al. 21

Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar con éxito una microinyección en embriones de nasonia vitripennis para facilitar la manipulación genómica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la biología de Nasonia vitripennis, como la producción de veneno y la determinación del sexo. La principal ventaja de utilizar esta técnica es que permite la manipulación directa en el genoma de la avispa y ofrece una amplia variedad de modificaciones genómicas avanzadas.La demostración del procedimiento estará a cargo de Ming Li, un post-doc de nuestro laboratorio. Para empezar, establezca varias colonias de N. vitripennis colocando de 200 a 500 adultos con una proporción de tres a uno de hembras y machos en jaulas de insectos. Mantenga las avispas a 25 más o menos un grado centígrado con 30% de humedad relativa y un ciclo de luz/oscuridad de 12 a 12.Durante dos días, permita que las hembras apareadas se alimenten de pupas frescas de S. bullata, así como de pequeñas gotas de una solución de agua de sacarosa de uno a diez volúmenes. Durante los dos días siguientes, retire las pupas de mosca para privar a las avispas hembras de un sitio de oviposición, haciéndolas muy grávidas. Para mantener frescos los huéspedes de las pupas de S. bullota, guárdelos a 4 grados centígrados inmediatamente después de obtenerlos y retírelos solo cuando sea necesario.Diferencie entre los huéspedes jóvenes que tienen un pupario de color rojo y los huéspedes mayores que tienen un pupario de color más oscuro. Permita que las avispas hembras parasiten al huésped joven colocando pupas frescas individuales de S. bullata en un tapón de espuma con un agujero del tamaño de una pupa cortado en el centro. Para obtener la máxima concentración de parasitación y facilitar la recolección de embriones, exponga solo unos 0,2 centímetros del extremo anterior del huésped, que es redondeado, en comparación con el extremo posterior, que es más grueso y contiene una abertura en forma de cráter.Coloque las pupas del huésped en este arreglo en la jaula y espere aproximadamente 45 minutos para permitir que las avispas las parasiten. Elimine los huéspedes parasitados recuperándolos con la mano y golpeando suavemente o soplando las avispas residuales. Reemplácelos con huéspedes frescos aproximadamente cada 15 minutos para continuar recolectando huevos en etapa temprana durante las inyecciones.Bajo un microscopio de disección, use fórceps para pelar cuidadosamente el extremo posterior del pupario exterior de un huésped recién parasitado para exponer los huevos de N. vitripennis. Luego, prepare un portaobjetos de alineación de embriones usando adhesivo líquido para pegar un portaobjetos de cubierta en un portaobjetos de vidrio limpio. Con un pincel húmedo de punta fina, cepille cuidadosamente los embriones del huésped, asegurándose de no dañar la suave piel de pupa del huésped.Luego, con el pincel húmedo, transfiera aproximadamente 20 embriones uno por uno al portaobjetos, inmediatamente adyacente al costado del cubreobjetos. Oriente el extremo anterior del embrión contra el borde del portaobjetos, de modo que los extremos posteriores del embrión apunten en la misma dirección. Esto permitirá una mayor precisión de inyección en la misma posición entre todos los embriones.Después de tirar de las agujas de inyección de acuerdo con el protocolo de texto, biselar la punta de la aguja tocando ligeramente la punta con una placa abrasiva de diamante a 25 grados centígrados durante aproximadamente 10 segundos. Prepare la mezcla de inyección que consiste en reactivos de modificación del genoma y manténgala en hielo. Utilice una punta de microcargador para cargar la aguja de inyección con dos microlitros de mezcla de inyección.Luego, coloque el portaobjetos de vidrio con los embriones alineados en la platina de un microscopio compuesto. Inserte con cuidado la aguja en el extremo posterior del embrión con un ángulo vertical de 25 a 35 grados. Luego, inyecte de uno a cinco picolitros de mezcla de inyección y asegúrese de que el embyro se hinche ligeramente con la inyección.Si se produce una obstrucción, intente volver a biselar las agujas. El citoplasma de los embriones de N. vitripennis es inusualmente viscoso y pegajoso, lo que conduce a la obstrucción frecuente de las agujas. Inyecte aproximadamente de 20 a 40 óvulos a la vez y luego deténgase.Transfiera los huevos inyectados con un pincel húmedo tocando ligeramente los huevos inyectados y colóquelos en un huésped. Luego, continúe inyectando, usando un lote de huevos frescos y recién puestos. Idealmente, este paso es más efectivo cuando una persona está recolectando y alineando óvulos, mientras que otra persona está inyectando componentes de modificación del genoma y trasplantando embriones inyectados en pupas del huésped.Después de la microinyección, use un pincel húmedo para colocar cuidadosamente hasta 40 embriones G zero inyectados, uno a la vez, sobre pupas de S. bullata previamente picadas. Coloque las pupas huésped en una placa de Petri con papel de filtro húmedo y bolas de algodón e incube a 25 grados centígrados con aproximadamente un 70% de humedad hasta que los embriones inyectados eclosionen en aproximadamente uno o dos días. Es importante destacar que los huéspedes pueden quedar con un pupario pelado, y los huevos de N. vitripennis se desarrollarán normalmente, siempre y cuando se incuben en una cámara humidificada para evitar la desecación.Después de que eclosionen los embriones G zero, transfiera las pupas huésped a una nueva placa de Petri e incube a 25 grados centígrados y 70% de humedad. Monitoree diariamente las pupas del huésped y las larvas G zero inyectadas. Si las pupas del huésped tienen un olor desagradable, transfiera las larvas inyectadas a nuevas pupas sanas del huésped.Para una penetración efectiva de la aguja y la microinyección en embriones de N. vitripennis, se probaron diferentes extractores de micropipetas con varios tipos de agujas de vidrio capilar con filamentos, incluidos cuarzo, aluminosilicato y borosilicato, para tener una punta larga hipodérmica deseada, efectiva para la microinyección de embriones de N. vitripennis. Los componentes de modificación del genoma utilizados aquí fueron ARN guía mixtos y proteína cas9 para la edición del genoma mediada por Crisper. En este experimento, se inyectó un sgRNA dirigido al gen del cinabrio en cantidades variables, junto con la proteína cas9, en N. vitripennis.Esta tabla muestra que las tasas de supervivencia fueron dependientes de la dosis, ya que el aumento de la concentración de sgRNA y la proteína cas9 condujo a una disminución de las tasas de supervivencia. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado de no perforar ni desecar los embriones de avispa durante la manipulación o transferencia utilizando cuidadosamente un pincel de punta fina humedecido o un palillo de embriones. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recuperar, microinyectar y trasplantar embriones de avispa de manera eficiente para realizar con éxito modificaciones avanzadas del genoma.

embryo-microinjection-transplantation-technique-for-nasonia

Research

JoVE Journal

Genetics

En organismos modelo, la transgénesis pueden manipular las funciones de genes, mientras que el ARNi puede caída transcripciones de ARNm específico de 1-2. Este protocolo tiene como objetivo ilustrar las técnicas necesarias para introducir ADN transmitido de forma estable y transitoria de ARN de doble cadena en el nemátodo...

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El objetivo de este protocolo es para describir un deficitaria y ganancia de función que el método es aplicable para identificar neogenin como un receptor de la etapa específica que lleva a trophectoderm y diferenciación masa celular interna de embriones de preimplantación ratón.

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Presentamos la transgénesis y transitoria gen desmontables en Ciona intestinalis, un grupo hermano cordado a los vertebrados, utilizando técnicas de microinyección y electroporación. Tales métodos facilitan la genómica funcional en este sencillo de invertebrados que cuenta con características rudimentarias de vertebrados, incluyendo notocorda y epitelios sensoriales cabeza, y muchos ortólogos de genes de enfermedades humanas asociadas.

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La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

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Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

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Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

Aquí hay protocolos para recolectar y microinyectar embriones precelulares de saltamontes de maíz con el fin de modificar su genoma a través de la edición del genoma basada en CRISPR / Cas9 o para la adición de elementos transponibles marcados a través de la transformación de la línea germinal.

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9

Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo optimizado para la microinyección de embriones, un paso crucial para la creación de moscas transgénicas.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Aprende a realizar microinyecciones en embriones de Nasonia vitripennis para facilitar modificaciones genómicas hereditarias. Este método permite manipular directamente el genoma de la avispa y avanzar en investigaciones sobre biología del veneno y determinación del sexo.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

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