Name: RNA de la guía CRISPR clonación de mamíferos sistemas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprende a clonar plásmidos de expresión de sgRNA para CRISPR mediante digestión con enzimas de restricción y ligación con T4 DNA ligasa. Este método eficiente de un solo paso facilita la creación de ARN guía pareados para edición génica.

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Sathiji Nageshwaran es apoyado por la Alianza de investigación de la Ataxia de Friedreich (07340305 - 01) y becas de la Fundación Ataxia nacional (7355538-01). Alejandro Chávez fue financiado por el Instituto Nacional del cáncer grant 5T32CA009216-34 y la Burroughs Wellcome Fund carrera premio para los científicos médicos. George M. Church es apoyado por los Estados Unidos institutos nacionales de salud (NIH) Instituto Nacional de investigación de genoma humano grant RM1 HG008525 y del Instituto Wyss de ingeniería biológicamente inspirados. James J. Collins reconoce apoyo de la beca de la Agencia de reducción de amenaza de defensa HDTRA1-14-1-0006 y el grupo de las fronteras de Paul G. Allen. Alejandro Chávez desarrolló el método de clonación de doble guía. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chávez y Nan Cher Yeo escribieron el manuscrito con la entrada de todos los autores.

Nota: El siguiente protocolo describe cómo realizar diseño de gRNA utilizando herramientas en línea (pasos 1.1-1.4), que son comunes a todos los métodos de construcción del plásmido de gRNA detallados en este manuscrito. Una vez que se identifican los gRNAs deseadas, pasos para pedir los oligonucleótidos necesarios se describen junto con varios métodos para introducir los oligonucleótidos en vectores de expresión (por ejemplo, pSB700). Se presentan 2 métodos de clonación de vectores guía expresando solo basados en cualquier ligadura en un vector de expresión predigerida (pasos 2-7.3) o Golden Gate clonación (pasos 8-8.4). Más descrito es una estrategia para clonación vectores guía expresando pares usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguida por Golden Gate clonación (pasos 11-16). Por último, también se describen métodos comunes para llevar a cabo una transformación química de e. coli (pasos 9-9.6) y una validación de secuencia del vector de expresión (pasos 10 a 10.2.3).
<ol><li>Diseño de oligonucleótidos de gRNA utilizando herramientas en línea como sigue.<ol>
<li>Diseño gRNAs usando herramientas en línea tales como el sgRNA Scorer 2.0 herramienta en línea (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 o alternativas como la herramienta de diseño de amplio sgRNA (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ diseño de sgRNA)14 y otros15.</li>
		<li>Utilizar el nombre de gen, símbolo o crudas secuencias blanco de ADN para generar secuencias de gRNA potencial. Nota: Se crea un archivo de hoja de cálculo (.csv/.xls) con todos los gRNAs potencial contra el gen o la secuencia proporcionada. La calidad de los gRNAs potenciales será reportada como puntuación si se usa la herramienta online sgRNA Scorer 2.0 o como % en el objetivo de eficiencia si se utiliza la herramienta de diseño de amplio sgRNA. Ambas medidas se derivan en basada en la actividad de corte en el blanco.</li>
		<li>Considerar la actividad fuera de objetivo en la selección de gRNA al ranking los gRNAs. Nota: Óptima guías son aquellos con la mayor eficiencia en el destino y la actividad menos objetivo. Para la activación (CRISPRa) gRNAs están diseñados para atacar la región de 1-200 bp aguas arriba del inicio transcripcional sitio (SAT)4,15. Para la inhibición (CRISPRi), gRNAs están diseñados para atacar la región de 50 bp, aguas arriba del TSS hasta 300 bp aguas abajo de la TSS5. Para desactivar un gen mediante corte Cas9, gRNAs están diseñados para apuntar el primer 10-50% de la secuencia de codificación aguas abajo de la iniciación codón (como gRNAs contra el extremo 3' del gen han demostrado ser menos efectivo)13.</li>
		<li>No sean sitios internos de BsmBI presentes si se utilizan oligonucleótidos para la clonación del Golden Gate, ya que esto en los oligonucleótidos recocidos ser digerida13.</li>
	</ol></li>
	<li>Seleccionar las secuencias genómicas blanco y quitar los 3' NGG PAM (dejando sólo la secuencia protospacer) para la modificación de secuencia del oligonucleótido de gRNA sola (por ejemplo, a partir de secuencia: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG). Nota: Si utiliza una hoja de cálculo, la siguiente fórmula eliminará 3' NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), donde A2 es la celda que contiene la secuencia de destino y el PAM.<ol>
<li>Añadir a CACCG al extremo 5' de la oligo. Nota: Sobre la ligadura a la espina dorsal de pSB700, esta secuencia estará formada por el extremo 3' del promotor U6 conduce la transcripción de la gRNA. La secuencia "CACC" asegura que el oligo es compatible con los voladizos del vector digerido BsmBI pSB700. La "G" es un requisito de los promotores de la polimerasa III y asegura la eficiente iniciación de la transcripción de la gRNA. Utilice la siguiente fórmula en una hoja de cálculo para realizar esta tarea: =CONCATENATE("CACCG",(B2)), donde B2 es la celda que contiene la secuencia de protospacer [p. ej., añadiendo el CACCG 5' la secuencia a la protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (esto es el oligo forward final que ordena)].</li>
		<li>Crear un complemento reverso (rc) de la secuencia de protospacer. Nota: por ejemplo, el complemento reverso de la protospacer mencionada es TGGATGAGGGAGAGCACGCG.</li>
		<li>Anexar AAAC al extremo 5' de la protospacer rc. Añadir una C adicional para el extremo 3' de la protospacer rc (oligo reverse). Nota: La secuencia "AAAC" asegura que el oligo es compatible para el clonado en el vector digerido BsmBI pSB700. La "C" adicional en el extremo 3' es necesario para templar la secuencia a la "G" iniciación a la oligo forward. Uso la siguiente fórmula en una hoja de cálculo para llevar a cabo esta tarea de =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C"), donde C2 es la celda que contiene la secuencia del complemento inverso [p. ej., AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (este es el final oligo inversa que es ordenado)].</li>
	</ol></li>
	<li>Ordenar los oligonucleótidos, sin modificaciones adicionales de los oligonucleótidos.<ol>
<li>Orden de la cantidad mínima de oligo requerido, como sólo muy pequeñas cantidades son necesarias para las reacciones de la clonación.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluir liofilizados iniciadores a una concentración final de 100 μM en el 1 x de tampón TE (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mm EDTA).</li>
	<li>Alícuotas 1:1 marcha adelante y atrás oligonucleótidos (por ejemplo, 10 μL cada uno) en tubos de tapón de tira PCR. Nota: Esto permitirá la clonación rápida de muchas gRNAs a la vez utilizando una pipeta multicanal.<ol>
<li>Vórtice y vuelta por las mezclas de oligo (100 x g por 15 s). Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de configurar la ligadura. Nota: No es necesario calentar y luego enfriar las mezclas oligo para facilitar su recocido. Cabe destacar que 3-4 pares de oligonucleótidos de gRNA pueden ser agrupados y recocidos en una sola reacción (por ejemplo, mezclar 3 μL de avance y 3 μL de inversa oligonucleótidos juntas de hasta 4 pares de oligo gRNA, dando un volumen total de 24 μL). El volumen de los oligonucleótidos utilizados para el recocido puede ajustarse para adaptarse a las necesidades de un usuario. Nota: Los pasos 6-7.3 describen la predigestion de pSB700. Para un método alternativo, consulte el paso 8, que describe una solo paso BsmBI restricción la ligadura.</li>
	</ol></li>
	<li>Resumen 1-5 μg del vector de expresión de guía las pSB700 con BsmBI (0,5 μL por 1 μg) por 1 h a 55 ° C15. Llevar a cabo la digestión del vector de expresión de gRNA pSB700 en un volumen total de 40 μL (tabla 1).<ol>
<li>Ejecutar los productos de la digestión en gel de agarosa de bajo punto de fusión de 1.5% (peso/vol).</li>
		<li>Corte la banda de la columna vertebral de vector digerido que corresponde a un fragmento de ~ 9 kb de tamaño y coloque la rebanada de gel en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (figura 1).</li>
		<li>Utilice un kit de purificación de gel comercial para extraer el ADN del gel de agarosa según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Eluir el ADN en 10-15 μL de tampón TE (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8.0) para obtener un efluente concentrado.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligar los oligonucleótidos gRNA recocido del paso 4 en el vector de expresión de guía pSB700 BsmBI digerido en una reacción de 20 μL (tabla 2) para la clonación de las gRNA oligonucleótidos en el vector de expresión de pSB700 previamente digerido.<ol>
<li>En primer lugar, agua, buffer y ADN, luego vórtice la mezcla y añadir enzima, vortex 1 tiempo final después de agregar la enzima y la rotación de la solución (100 x g por 15 s). Incubar durante una noche las reacciones a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incluyen una reacción de no insertar control negativo que tiene un vector digerido BsmBI solo, sin un gRNA recocido oligo inserto. 1 μL de agua puede utilizarse en lugar de 1 μL de gRNA oligonucleótidos para el control negativo no insertar.</li>
		<li>Proceder a la transformación (paso 9). Nota: El paso 8 es un método alternativo a la predigestion de pSB700 como se describe en los pasos 6-7.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Introducir el vector de pSB700 mediante el uso de Golden Gate de la reproducción para la ligadura de restricción de BsmBI solo paso a gRNA oligonucleótidos (descritos en los pasos 1-5.1).<ol>
<li>Montar la mezcla master (1 x): si gRNAs múltiples están siendo clonados, preparar la mezcla principal sin los oligonucleótidos inserto añadidos (tabla 3). Alícuota el maestro de la mezcla en tubos de PCR y utilizar una pipeta multicanal para agregar el gRNA oligonucleótidos en el paso 4.2. Incluir un control insert no con 1 μL de agua.</li>
		<li>Mediante la inclusión de la enzima BsmBI y ligase de la DNA de T4 dentro de la misma reacción, digestión de restricción simultánea y ligadura se realiza (es decir, clonación de Golden Gate). Utilizar el siguiente protocolo Simple de la puerta para digerir el vector y ligar los insertos en la 1 reacción: mantener la reacción a 37 ° C por 2 h, a 50 ° C durante 10 minutos, a 65 ° C durante 15 minutos, a 80 ° C durante 15 min y finalmente , mantener a 4 ° C.<ol>
<li>De nota, verificar que los oligonucleótidos no contienen sitios de BsmBI antes de usar este método. Si los gRNAs que están siendo clonados contienen sitios de restricción de BsmBI, a ser digeridos con la adición de BsmBI. Esto evitará que el usuario obtener cualquier transformantes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Después de la inicial reacción de puerta Simple, añadir un adicional 0,5 μL de enzima de BsmBI a cada reacción y colocarlos a 55 ° C durante 1 hora. Después de la digestión, mantener la reacción a 4 ° C o congelar hasta que esté listo para transformar. Esta segunda ronda de incubación de la enzima de la restricción elimina cualquier de indigerido o religated pSB700 tipo vector columna vertebral de la mezcla de reacción para que sólo los vectores que han recibido los insertos oligo permanecen intactos y producen transformantes.</li>
		<li>Proceder a la transformación (paso 9).</li>
	</ol></li>
	<li>Transformar 0,5 μL de la mezcla de reacción de 8 μL de competentes de e. coli [e.g., NEB DH5a (1-3 x 109 UFC/μg de DNA de pUC19) o NEB estable 1 - 3 x 109 UFC/μg de DNA de pUC19). Para plásmidos lentivirales, células NEB estable proporcionará más consistente rendimiento de plásmido.<ol>
<li>Quitar la e. coli de almacenamiento a-80 ° C y descongelar en hielo durante 5-10 minutos.</li>
		<li>Añadir 0,5 μL de la mezcla de reacción a 8 μL de competente e. coli y mantener la mezcla en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Choque de calor la mezcla a 42 ° C por 45 s.</li>
		<li>Descansar en hielo durante 2 minutos.</li>
		<li>Recuperar la cultura en un agitador rotatorio en 250 μL de medio SOC durante 1 h a 37 ° C para NEB DH5a y a 30 ° C para establos de NEB.</li>
		<li>Plato 80 μL de la cultura en una resistencia a los antibióticos apropiada caldo de lisogenia (LB) la placa e incubar durante una noche a 37 ° C para NEB DH5a y a 30 ° C para NEB establos [por ejemplo, pSB700 es plateado en LB con placas ampicilina (100 μg/mL)] (figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Validar la secuencia del plásmido de expresión de gRNA: verificar la secuencia de cada colonia por Sanger secuenciación utilizando el primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' que primes en el promotor U6 aguas arriba de la gRNA oligo insertar.<ol>
<li>Toma 2-3 colonias por reacción de secuenciación (tabla 4). Nota: Varios proveedores de secuenciación ahora ofrecen servicios que pueden realizar Sanger secuenciación directa de colonias bacterianas, lo cual reduce el tiempo y costes al eliminar la necesidad de purificar la plásmidos antes de la secuencia. Alternativamente, puede utilizarse un kit de aislamiento de plásmidos para recuperar el ADN de plásmido de los clones bacterianos individuales. Plásmidos purificados pueden presentarse luego de la secuencia. Si se realiza una reacción de ligadura combinada, guíese por la tabla 4 para el número de colonias que deben ser seleccionados y presentados para la secuencia.</li>
		<li>Tras la confirmación de la secuencia, aislar la plásmidos de expresión gRNA.<ol>
<li>Utilizar una pipeta estéril para inocular la Colonia deseada en una cultura de 5 mL de medio LB que contiene 100 μg/mL de ampicilina para vectores de expresión pSB700.</li>
			<li>Crecen las células en una incubadora rotatoria a 100 rpm a 37 ° C durante la noche (30 ° C si se utilizan establos de NEB).</li>
			<li>Aislar el ADN del plásmido de las culturas usando un kit de preparación de plásmido, siguiendo el protocolo del fabricante. Nota: Mientras que los métodos anteriores permiten a los usuarios crear vectores que contienen el gRNA sola, este protocolo permite a los usuarios crear vectores que contienen 2 gRNAs, cada uno impulsado por su propio promotor de RNA polimerasa III.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Un gRNA emparejados diseño, utilice el archivo de salida de las herramientas de diseño sgRNA mencionados anteriormente (pasos 1.1-1.4) y seleccione a 2 guías de interés.<ol>
<li>Para una activación o represión, seleccione pares de guías que son al menos 30 nt aparte.</li>
		<li>Para gRNAs usados para el corte, seleccione a guías dirigidos a 2 diferentes exones en el gen.</li>
	</ol></li>
	<li>Para las instrucciones a continuación, designar el gRNA primero en la matriz de gRNA-A y la gRNA segundo en el gRNA variedad-B, para crear una modificación de secuencia del oligonucleótido de gRNA emparejados. Nota: El oligo que utiliza para crear gRNA-A se llamará fA, y el oligo inversa utilizado para introducir gRNA-B se denominará rB. El método de clonación por debajo automáticamente agrega un iniciador G en el extremo 5' de cada uno de los gRNAs.<ol>
<li>Crear el oligo fA apropiadas como sigue. Nota: Los 20 nucleótidos formado por el gRNA a secuencia de gRNA-A voluntad constituyen la secuencia fA inicial sobre la que construirá a los siguientes pasos (p. ej., protospacer - aggggctacaccactcattg).<ol>
<li>Añadir a TTTTCGTCTCTCACCG al extremo 5' de fA (por ejemplo, de la secuencia TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).</li>
			<li>Añadir a GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA al extremo 3' de fA (por ejemplo, de la secuencia TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Esta es la versión final de la oligo de fA que se ordenará.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Crear el necesario oligo rB como sigue. Nota: Los 20 nucleótidos que comprende la secuencia dirigida a gRNA gRNA b constituirán la secuencia inicial de la rB que construirá a los siguientes pasos (por ejemplo, de la gtcccctccaccccacagtg a partir de la secuencia).<ol>
<li>Tomar el complemento reverso de rB = (revcom) rB (e.g., cactgtggggtggaggggac).</li>
			<li>Añadir a TTTTCGTCTCTAAAC al extremo 5' de (revcom) rB (por ej., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).</li>
			<li>Añadir a CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG al extremo 3' de (revcom) rB (p. ej., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Esta es la versión final de la oligo de rB que se ordenará. Nota: las siguientes fórmulas pueden utilizarse con software de hoja de cálculo común para editar automáticamente las secuencias de oligo: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), donde A2 es la celda que contiene la secuencia de fA y = Concatenate("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2),"CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), donde B2 es la celda que contiene la secuencia de rB (revcom).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ordenar los oligonucleótidos de un proveedor de síntesis de la opción. Modificaciones adicionales no se requieren.</li>
	<li>Utilizar el ADN del plásmido preparado para realizar la PCR con iniciadores de fA y rB. Esto fijará tanto el avance y las inversas gRNAs al fragmento de PCR generados de este plásmido y permitir que cada uno a expresarse desde su propio promotor (U6 y 7SK promotores — diferentes promotores se utilizan en este diseño para evitar la recombinación viral).<ol>
<li>Utilizar el protocolo de PCR especial de Phusion GC para crear el fragmento necesario: mantener la mezcla a 98 ° C por 1 min (1 ciclo), a 98 ° C por 15 s a 53 ° C durante 15 s, 65 ° C por 2 min y 72 ° C por 4 minutos (30 ciclos) y luego mantenerla a 4 ° C (tabla 5).</li>
		<li>Ejecutar el producto PCR en un gel de agarosa al 1% y verificar que la 1 banda es vista en ~ 490 bp (figura 2).</li>
		<li>Cortar y extraer este producto PCR utilizando un kit de extracción de gel de elección. Eluir el ADN en 15 μL de tampón TE (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8.0) o agua destilada.</li>
		<li>Medir la concentración del producto extraído junto con el vector de pSB700 con un espectrofotómetro para el cálculo de la molaridad de ADN. Normalizar el producto PCR y el vector a una concentración de 40 femtomoles/μL. Nota: Varios sitios web está disponible para ayudar con el cálculo de la molaridad de una solución de ADN determinada basada en la longitud de la DNA y su concentración en la solución (p. ej., Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). La calculadora utiliza la fórmula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57998/57998eq1.jpg"> Aquí, N es la longitud de la secuencia de nucleótidos.</li>
	</ol></li>
	<li>Establecer una reacción de digestión y la ligadura de restricción simultánea utilizando el protocolo descrito en los pasos 8-8.4 para clonar el fragmento de la polimerización en cadena en un vector de pSB700.<ol>
<li>En lugar de agregar 1 μL de solución de imprimación a la reacción, añadir 1 μL de 40 fmole/μL del producto PCR. Además, use 1 μL del vector pSB700 en una concentración de 40 fmole/μL. Nota: Relaciones molares igual conducen a resultados consistentes, aunque incluso en casos donde no se usan proporciones exactas, se pueden obtener colonias.</li>
	</ol></li>
	<li>Al completar el proceso de la reacción del Golden Gate (pasos 8-8,4), proceder a la verificación de la transformación y la secuencia (pasos 9 - 10.2.3).</li>
</ol>

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<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
</ol>

George M. Church tiene equidad en la Editas y caribú Biosciences, cuyo objetivo es comercializar CRISPR Cas9 genoma tecnología de edición (para una lista de full disclosure, por favor consulte http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).

Se hicieron una serie de modificaciones de tiempo y ahorro en la construcción de vectores de expresión de gRNA. Un protocolo de restricción y la ligadura solo paso se perfila así como un método de construcción de vectores de expresión gRNA emparejados. La expresión de gRNA emparejados se logra a través de una amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos que contienen una secuencia de destino gRNA avance (n20) y el complemento reverso de otro objetivo (n20). Entonces este introduce a un promotor de RNA Pol III secundario (7SK) así como una cola sgRNA en expresar convencionalmente una gRNA plásmidos de expresión.
Un diseño cuidadoso del oligonucleótido asegurará una polimerización en cadena acertada para la construcción de gRNA apareadas así como una ligadura adhesiva final. Tras la restricción solo paso y la reacción de la ligadura, la adición de más BsmBI asegurará que todos los vectores de expresión sin modificar en la reacción se cortan. Esto reducirá significativamente el fondo en la transformación. Uso de NEB-estable competente e. coli y un crecimiento a 30 ° C aumentará el rendimiento de una transformación exitosa.
Las ventajas de que esta técnica tiene sobre las prácticas comunes incluyen una simplificación del proceso de recocido, una solo paso la restricción del vector de expresión de gRNA y la ligación de oligonucleótidos y la capacidad para utilizar los convencionales de oligonucleótidos gRNA solo vectores de expresión para la expresión de guías emparejados. Mientras que el protocolo había descrito aquí se centra en un conjunto de vectores de mamíferos, la estrategia general es de plástico y es aplicable a cualquier organismo, siempre y cuando el vector de gRNA apropiado está disponible. En general, el protocolo descrito ahorra tiempo y costos.
Sin embargo, debe señalarse que el procedimiento contorneado de comprar los oligonucleótidos no escala bien para la generación de bibliotecas que contienen miles de gRNAs. Para esos fines, se recomiendan alternativas de síntesis de oligonucleótidos como síntesis de oligo chip.
Es beneficioso incluir un control de no insertar al clonación gRNAs. Esta reacción puede configurarse fácilmente en paralelo con las reacciones de interés y puede utilizarse para determinar si una digestión incompleta del vector inicial ha contribuido a las colonias observadas al final del procedimiento. Además, si uno de los protocolos de clonación anteriores ha fallado debido a un esqueleto incompletamente digeridas vector o ligadura deficiente eficiencia, sugerimos probar la alternativa clonación método que hemos descrito.
Cuando Golden Gate clonación para digerir el vector y ligar en los oligonucleótidos pequeños dentro de una sola reacción al mismo tiempo, es importante comprobar que el gRNA que están siendo clonados en el vector no tiene un sitio BsmBI dentro de ella, ya se que t gRNA cortan y una ausencia de colonias en transformación.
El gRNA estrategia que hemos descrito la clonación permite una generación rápida y rentable de gRNAs a ~ 10 dólares por la guía, la mayor parte de los costos provenientes de la síntesis de oligonucleótidos y la verificación de la secuencia. Mientras que el método se describe está diseñado para permitir a los usuarios generar gRNAs para uso con SpCas9, el protocolo puede ser fácilmente adaptado para su uso con Cas9 orthologues u otras endonucleasas RNA-dirigida como Cpf1 o C2C2, con ligeras modificaciones en la columna vertebral del vector y la proyección de oligonucleótidos secuencias de16,17.
El protocolo descrito anteriormente proporcionará gRNA secuencia verificada plásmidos de expresión en 3 d (a partir de oligonucleótidos diseñados adecuadamente), que es significativamente más rápido que los métodos actuales. Esto incluye el diseño de gRNA de h 1 (pasos 1-2.3), la dilución y alícuota de oligonucleótidos de 10 minutos (pasos 3-5.1), la digestión y la purificación del vector de expresión de gRNA pSB700 de 2 h (pasos 6-6.4), la clonación de los oligonucleótidos de gRNA en un predi vector de expresión de gRNA pSB700 gested durante la noche a temperatura ambiente (pasos 7-7.3), la ligadura de restricción de BsmBI solo paso de 3 h y 40 minutos (pasos 8-8.4), la transformación de 16 h (pasos 9-9.6) y la validación de la secuencia del plásmido de expresión de gRNA de 24 h (con la duración dependiendo de la disponibilidad de secuenciación de sanger y la velocidad tras la presentación de la Colonia bacteriana; paso 10). El diseño de gRNA apareadas y la modificación de la secuencia toma 1 h (pasos 11-13). El gRNA pareada PCR lleva 3,5 h (pasos 14-14.4). La clonación del fragmento PCR en un vector de pSB700 tarda 3h y 40 minutos (paso 15-16).
Lo más probable es que puede ser enfrentado con este protocolo se relacionan con la ineficiencia en la Asamblea de Golden Gate y la transformación. Incluir un control de no insertar durante la Asamblea de Golden Gate para visualizar la eficacia de la Asamblea. Durante la transformación, el control positivo de puc19 proporcionará un control de eficiencia de transformación. NEB-estable e. coli puede usarse para plásmidos compatibles lentivirales y requieren con frecuencia hasta > 16 h a 30 ° C para producir colonias visibles.

Proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9) es una endonucleasa RNA-dirigida que se dirige hacia un objetivo deseado genomic al complejado con un pequeña guía adecuadamente diseñado RNA (gRNA)1,2. gRNAs comprenden una secuencia de 20 nucleótidos (el protospacer), que es complementaria a la secuencia de genomic de destino. Junto a la meta genómica secuencia es un 3' asociada a protospacer motivo (PAM), que se requiere para el atascamiento de Cas9. En el caso de Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), esto tiene la secuencia NGG. En vinculante el objetivo de ADN, Cas9 separa ambas hebras de ADN, así estimular los mecanismos de reparación que puedan ser explotados para modificar el lugar de interés. La activación de la vía de (NHEJ) end-joining propenso no homóloga puede causar la interrupción de un gene de la blanco. Alternativamente, las reparaciones efectuadas a través de una recombinación homóloga puede estimular la integración específica de una secuencia de ADN deseada si se proporciona una plantilla de donantes6. Nucleasa muertos Cas9 variantes (dCas9) también pueden ser generado3 por mutación de los residuos dentro de Cas9 que son esenciales para la actividad endonucleolítica. dCas9 sigue siendo competente para el atascamiento de la DNA pero no corta su destino consolidado. Fusionando varios dominios efector para dCas9 y dirigir cerca de sitio de inicio transcripcional de un gen, dCas9 puede utilizarse para la inducción del gen selectivo o parcial4,5el silenciamiento del gen.
Aunque increíblemente poderosa, la habilidad de usar Cas9 para apuntar una secuencia genómica de interés requiere que un usuario genera primero un gRNA única en el sitio de destino. Una variedad de métodos para la construcción de gRNA vectores de expresión han sido previamente descritas, muchas de las variable eficiencia y costo6,7,8. Independiente amplicones de PCR pueden utilizarse como gRNAs de cribado rápido, va desde entrega de oligonucleótidos para la transfección dentro de varias horas; sin embargo, esto requiere Ultramer (más de 100 bp) síntesis del oligo, que es caro9. También es posible comprar gBlocks que son más rentables que Ultramers. Como Cas9 ha convertido rápidamente en un componente integral de las herramientas de la biología molecular moderna, un método simple, barato y altamente eficiente para la gRNA clonación sería una bendición para el campo. El método descrito aquí ha sido empleado en nuestro grupo y laboratorios colaboradores durante los últimos años para generar más 2.000 gRNAs única4.
El método de contorneado se centra en técnicas para la clonación de vectores lentivirales compatibles con un gRNA sola o a lo sumo dos gRNAs. Para la generación de plásmidos que contienen más de dos gRNAs, o clonar una biblioteca de gRNAs, alternativas se recomiendan9,10,11,12.

<table><tbody><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasa</td><td>Enzimática/New England Biolabs</td><td>L6030-LC-L/M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato (ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Químicamente competentes E. coli</td><td>New England Biolabs</td> Tubos de microcentrífuga estándar <td>C3019l, C2987l o C3040H</td><td></td></tr><tr><td>, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Tubos de PCR de 8 tiras</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-222-250</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador con control de temperatura programable</td><td>BioRad,1851148</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>UV espectrofotómetro (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSB700 plásmido</td><td>Addgene</td><td>#64046</td><td></td></tr><tr><td>NEB Estable Competente E. coli (Alta eficiencia)</td><td>New England Biolabs</td><td>c3040</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de lisogenia (LB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón ampicilina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSN007 plásmido</td><td>Addgene</td><td><a href="https://www.addgene.org/102440/">102440</a></td><td></td></tr></tbody></table>

rna de la guía crispr clonación de mamíferos sistemas

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

El protocolo describe métodos racionalizados para la generación eficiente y rentable de Cas9 asociado guía RNAs. Se describen dos estrategias alternativas para la clonación de RNA (gRNA) guía basado en el uso de la enzima de restricción tipo IIS BsmBI en combinación con un conjunto de vectores compatibles. Fuera el acceso a servicios de secuenciación de Sanger para validar los vectores generados, ningún equipo especial o reactivos se requieren además de los estándar a los laboratorios de biología molecular moderna. El método se describe está destinado principalmente para la clonación una gRNA solo o un vector pareada gRNA expresando a la vez. Este procedimiento no escala bien para la generación de bibliotecas que contienen miles de gRNAs. Para esos fines, se recomiendan alternativas de síntesis de oligonucleótidos como síntesis de oligo-chip. Por último, si bien este protocolo se centra en un conjunto de vectores mamíferos, la estrategia general es de plástico y es aplicable a cualquier organismo, si el vector de gRNA apropiado está disponible.

Los métodos establecidos en este protocolo son la creación de cualquiera de los dos vectores de expresión de gRNA unitarios o emparejados. GRNA solo expresar vectores puede ser creado por cualquiera de los dos predigesting vector columna vertebral (figura 1) seguida de ligadura en una serie de oligonucleótidos cortos o el uso de Golden Gate clonación para digerir al mismo tiempo el eje vector y ligar en un serie de oligonucleótidos cortos en una sola reacción. También es un método de producir vectores que contienen 2 gRNAs, cada uno impulsado por su propio promotor independiente, mediante la clonación de un fragmento PCR medido (figura 2).
Una clonación exitosa de cualquiera de los protocolos se dará lugar a la aparición de colonias mucho más las transformaciones con el ADN de relleno apropiado que en la placa de control no-insertar (figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig1.jpg"> Figura 1: la digestión de un vector de expresión de gRNA pSB700. se utiliza el gel de agarosa al 1%. Carril 1: pSB700 sin cortar. Carril 2: corte el pSB700 con BsmBI.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig2.jpg"> Figura 2: emparejado gRNA PCR. se utiliza el gel de agarosa al 1%. Carril 1: un guía pareadas PCR fragmento de ~ 490 bp.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig3.jpg"> Figura 3: la exitosa clonación y transformación de un plásmido de gRNA. El panel izquierdo muestra una LB y placa de ampicilina con transformado con éxito las colonias. El panel derecho muestra una placa de control no insertar no mostrando colonias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57998/57998fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>pSB700 vector guía de la expresión</td>
			<td>1-5 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEB Buffer 3.1</td>
			<td>4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua destilada</td>
			<td>hasta 40 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen total</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: La digestión de la restricción de un vector de expresión de gRNA pSB700 con BsmBI.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>GRNA recocido oligos (reacción ya sea solo o agrupada)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vector de expresión digerido BsmBI pSB700 guía</td>
			<td>1 μL (~ 100-250 ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x Buffer de reacción de T4 ADN ligasa</td>
			<td>2 μL (1 x concentración final)</td>
		</tr>
<tr>
<td>T4 ADN ligasa</td>
			<td>1 μL (120 unidades)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua destilada</td>
			<td>15 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen total</td>
			<td>20 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Una reacción de la ligadura de gRNA oligonucleótidos en un vector de expresión de gRNA pSB700 predigerida.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivo de</td>
			<td>Volumen (1 x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ligasa de T4</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEB Buffer 3.1</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vector (por ejemplo, pSB700) (40 fmol)</td>
			<td>1 μlL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Insertar - adelante y atrás oligos o fragmento de la polimerización en cadena para doble guía (40fmol)</td>
			<td>1 μL (0,5 μL hacia adelante y reversa 0,5 μL)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Mezclan de un solo paso BsmBI restricción y gRNA reacción de ligadura.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Guía 1</td>
			<td>secuencia 3 colonias</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 guías de</td>
			<td>secuencia de 5 a 10 colonias</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 guías de</td>
			<td>la secuencia de 10 a 15 colonias</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 guías de</td>
			<td>la secuencia de 15-20 colonias</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: La cantidad recomendada de colonias a secuencia de gRNA agrupado clonación reacciones.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente de la polimerización en cadena</td>
			<td>Reacción de 50 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer avance de 10 μm</td>
			<td>2,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer revés de 10 μm</td>
			<td>2,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x Phusion HF o GC Buffer</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plantilla de ADN</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polimerasa de la DNA de Phusion</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de nucleasas</td>
			<td>Hasta 50 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 5: Una mezcla de la PCR gRNA emparejados.

Aquí, una simple, eficaz y rentable método de clonación sgRNA se contornea.

RNA de la guía CRISPR clonación de mamíferos sistemas

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Este método permite facilitar la creación de plásmidos de expresión de ARN guía para experimentos facilitados por CRISPR. La principal ventaja de esta técnica es que la clonación se puede llevar a cabo en un solo paso y se pueden crear ARN guías emparejados utilizando plásmidos de expresión de ARN de una sola guía. Para comenzar este protocolo, diluya las imprimaciones liofilizadas en tampón 1X TE a una concentración final de 100 micromolares.Aliquot una cantidad igual de imprimadores hacia adelante y hacia atrás en tubos de tapa de tira PCR. Vórtice para mezclar. A continuación, gire hacia abajo las mezclas de oligonucleótidos de ARN guía a 100 veces G durante 15 segundos.Incubar la reacción a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de configurar la ligadura. Añadir entre uno y cinco microgramos del vector de expresión de guía PSB700 seleccionado a BSNB1 utilizando 0,5 microlitros de BSNB1 por cada microgramo de vector. Añadir agua destilada hasta que el volumen total sea de 40 microlitros y realizar la digestión durante una hora a 55 grados centígrados.Ejecuta los productos de digestión con un gel de agarosa de fusión 1,5% bajo. Corte la banda de estructura básica vectorial digerida que corresponde a un fragmento de aproximadamente 9 kilobases de tamaño. Transfiera esta rodaja de gel a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Usando un kit comercial de purificación de gel, extraiga el ADN del gel de agarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, diluir el ADN en 10-15 microlitros de tampón TE para obtener un elute concentrado. Cuando esté listo para realizar la ligadura, añada 15 microlitros de agua destilada a un vial.Agregue 1 microlitro de los oligonucleótidos de ARN guía previamente recocidos, un microlitro del vector de expresión guía PSB700 digerido BSNB1 y 2 microlitros de tampón de reacción de ligasa de ADN 10XT4. A continuación, mezcle esta solución por vórtice. Agregue un microlitro de ligasa de ADN y vórtice de nuevo.Gire hacia abajo la solución a 100 veces G durante 15 segundos. Incubar las reacciones a temperatura ambiente durante la noche asegurándose de incluir una reacción de control negativo sin inserción que tenga un vector digerido BSNB1 solo sin un inserto de oligote de ARN guía recocido. Para empezar, retire E.coli del almacenamiento a menos 80 grados Centígrados y descongele sobre hielo durante 5 a 10 minutos.Añadir 0,5 microlitros de la mezcla de reacción preparada a ocho microlitros de E.coli competente. Mantener la mezcla sobre hielo durante 30 minutos. Golpee la mezcla a 42 grados Centígrados durante 45 segundos.Luego deje reposar la mezcla sobre hielo durante dos minutos. Usando una coctelera giratoria, recupere el cultivo en 250 microlitros de medios SOC utilizando las condiciones enumeradas aquí para NEB DH5a o NEB Stables. Después de esto, plato 80 microlitros del cultivo en una placa de caldo de lisogenia de resistencia a antibióticos apropiada.Incubar durante la noche a 37 grados centígrados para NEB DH5a o a 30 grados Celsius para establos NEB. Para comenzar, utilice el protocolo PCR especial Phusion GC para crear el fragmento necesario como se describe en el protocolo de texto. Ejecute este producto PCR en un gel de 1% de agarosa y verifique que una banda se vea en aproximadamente 490 pares base.Usando un kit de extracción de gel cortar y extraer este producto PCR. A continuación, aliquot una mezcla maestra 1X preparada en tubos PCR. Utilizar una pipeta multicanal para añadir un microlitro del producto PCR a una concentración de 40 femotocinas por microlitro.En un microlitro del vector PSB700 añadir una concentración de 40 femtomoles por microlitro. Incluya un control sin inserción utilizando un microlitro de agua en lugar de los oligonucleótidos de ARN guía. Digerir el vector y ligar las inserciones en una reacción utilizando el protocolo Golden Gate descrito en el protocolo de texto.Después de la reacción inicial de la puerta dorada añadir 0,5 microlitros adicionales de la enzima BSNB1 a cada reacción. Continúe la reacción a 55 grados centígrados durante una hora. Cuando la reacción de la puerta dorada esté completa, proceda al proceso de transformación de E.coli descrito anteriormente.En este estudio, los vectores de expresión de ARN de guía única se crean correctamente utilizando dos métodos. En el primer método, la columna vertebral del vector se digiere previamente y se liga en una serie de oligonucleótidos cortos. El segundo método utilizaba la clonación de puerta dorada para digerir y ligar simultáneamente en una sola reacción.ARN guía emparejado que expresa vectores, cada uno impulsado por su propio promotor independiente se crean con éxito mediante la clonación de un fragmento de PCR personalizado. La clonación exitosa para cualquiera de estos métodos dará lugar a la aparición de significativamente más colonias para transformaciones con el ADN de inserción adecuado en comparación con la placa de control sin inserción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar no incluir ningún control de inserción en el paso de clonación.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la ingeniería de epigenomas para responder preguntas como qué efectos tienen las firmas de cromatina en la expresión génica.

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Research

JoVE Journal

Genetics

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