Name: Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a preparar láminas agudas de médula espinal para grabaciones patch-clamp en neuronas de la sustancia gelatinosa. Este método permite estudiar propiedades electrofisiológicas y mecanismos del dolor crónico.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81560198, 31660289).

Todos los protocolos experimentales descritos fueron aprobados por el Animal ética Comité de Nanchang University (Nanchang, China PR, ética No.2017-010). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el estrés y el dolor de los animales experimentales. Las grabaciones electrofisiológicas realizadas aquí se llevaron a cabo a temperatura ambiente (RT, 22 – 25 ° C).
1. los animales
<ol><li>Uso de ratas Sprague-Dawley (3 – 5 semanas) de ambos sexos. Los animales bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h de la casa y darles acceso ad libitum al agua y una alimentación adecuada.</li>
</ol>2. preparación de soluciones y materiales
<ol><li>Soluciones<ol>
<li>Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (en mM): NaCl 117, 3.6 KCl, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucosa, ácido ascórbico 0,4 y 2 piruvato de sodio. Vea la tabla 1.</li>
		<li>Preparar la ACSF de sacarosa (en mM): 240 sacarosa, 2,5 KCl, 1.25 NaH2PO4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 ácido ascórbico y piruvato de sodio 2. Consulte la tabla 2.</li>
		<li>Preparar K+-solución intracelular (en mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 Na2-fosfocreatina, EGTA 0,5, 10 HEPES, 4 Mg-ATP y 0.3 Li-GTP. Consulte la tabla 3.</li>
		<li>Preparar Cs+-solución intracelular (en mM): 92 CsMeSO4, CsCl 43, 10 Na2-fosfocreatina, 5 Tetraetilamonio (TEA) - Cl 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP y 0.3 Li-GTP. Véase el cuadro 4. Nota: Todas las soluciones deben prepararse con agua destilada. ACSF y sacarosa ACSF deben ser carbogenated (95% O2 y 5% CO2 mezcla) antes de su uso para mantener un pH óptimo de aproximadamente 7.4, y la osmolalidad de estas dos soluciones se debe ajustar a 300-310 mOsm. Porque el ácido ascórbico puede afectar los canales de calcio, este agente debe omitirse si uno quisiera grabar las corrientes de calcio. La osmolalidad y el pH de soluciones intracelulares deben ser medidos y ajustados a 290-300 mOsm y 7.2, 7.3, respectivamente. Se recomienda filtrar las soluciones intracelulares con 0,2 μm filtros y almacenar las soluciones como alícuotas de 1 mL a-20 ° C. CS+ y té se aplican en Cs+-basado en la solución intracelular al bloque del canal de potasio, que es propicio para usar el amplificador para sujetar la membrana potencial constante en 0 mV cuando graba corrientes postsinápticas inhibitorias (IPSCs).</li>
		<li>Preparar la solución neurobiotin 488 al 0,05%. Disolver 2 mg de neurobiotin 488 en 4 mL de K+-solución intracelular y ajustar la osmolalidad de 290-300 mOsm usando agua destilada o sacarosa, si es necesario. Nota: 1 mM de sacarosa aumenta osmolaridad 1 mOsm.</li>
		<li>Preparar agar al 3% como un bloque para la médula espinal. Disolver 7,5 g de agar en 250 mL de agua purificada en un vaso de vidrio y luego usar un microondas para calentar hasta que hierva y claro. Agitar la solución y vierta la mezcla en una 17,5 cm x 10,5 cm x 1.8 cm caja de plástico para solidificación luego. Mantener el agar a 4 ° C antes de usarlo.</li>
		<li>Preparar 4% paraformaldehido (PFA) para el procesamiento de immunohistochemical. Mezcla 40 g de polvo PFA a ~ 800 mL de calentado (aproximadamente 60 ° C) 1 x solución de PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Ajuste lentamente el pH añadiendo gotas de NaOH N 1 hasta PFA polvo se disuelva completamente. Una vez que la solución es clara, ajustar el volumen total a 1 L con PBS 1 x. Vuelva a ajustar el pH a 7.2-7.4, con 1 N HCl cuando sea necesario, luego filtrar la solución PFA 4% y almacenar a-20 ° C hasta su uso. Nota: El PFA es tóxico, por lo que es necesario usar máscaras, guantes y gafas de seguridad. Llevar a cabo el proceso de preparación 4% PDA dentro de una campana ventilada. Polvo PFA puede disolverse completamente en un pH de aproximadamente 9-10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instrumentos
	<ol>
<li>Para un sistema electrofisiológico típico, usar un microscopio vertical equipado con contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) y un objetivo de inmersión de agua de alta resolución, una cámara de CCD/CMOS, un amplificador de la abrazadera del remiendo, un sostenedor de la micropipeta y instrumental quirúrgico que permite ajuste fino de la posición de la pipeta. Una etapa XY también es necesaria para mover el microscopio.</li>
		<li>Montar todo el equipo en una tabla de aislamiento de vibración rodeado por una jaula de Faraday. Conecte a un monitor de vídeo a la cámara de video para observar las neuronas y visualizar las Micropipetas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micropipetas
	<ol>
<li>Hacer electrodos de grabación de Capillares de vidrio de borosilicato con un extractor de micropipeta. Los rangos de resistencia típica pipeta de MΩ 3-6 cuando se llena con solución intracelular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloque de agar
	<ol>
<li>Preparar un 1,2 x 1,5 cm x bloque de agar de 2.0 cm. Recortar el bloque en las formas que se muestra en la figura 1 como sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. aguda de la médula espinal sector preparación
Nota: Transverso o parasagittal rebanadas de médula espinal se preparan como anteriormente descrito18,19,20.
<ol><li>Antes de transcardial perfusión y extracción de la médula espinal, preparar ~ 500 mL sacarosa-ACSF equilibrado con 95% O2 y 5% CO2 y enfríe la solución a la helada (0 – 4 ° C).</li>
	<li>Enfriar todas las herramientas de disección (p. ej., disección, tijeras, tijeras de iris, pinzas dentadas, pinzas finas, pinzas curvas) sobre el hielo. El diagrama de la preparación del segmento medular aguda se muestra en la figura 1.</li>
	<li>Transcardial perfusión<ol>
<li>Después de una sola inyección de uretano (1,5 g/kg) (intraperitoneal, i.p.), espere de 2 a 3 minutos y evaluar la profundidad de la anestesia de las ratas por la prueba del dedo del pie o cola pizca respuestas. Una vez que se mantiene un plano quirúrgico de anestesia, colocar la rata en hielo picado en la posición supina. Nota: Para producir anestesia profunda suficiente para la no percepción del dolor durante la toracotomía, seguir sus pautas locales de IACUC.</li>
		<li>Hacer una incisión (3 – 4 cm) a través de la piel del proceso xifoides a la clavícula y luego realizar una incisión transversal debajo del nivel del proceso xifoides.</li>
		<li>Sujete y levante el proceso xifoide con un par de pinzas curvas para exponer completamente el diafragma. Hacer una incisión transversal a través del diafragma y luego atravesar el tórax entre el esternón y las costillas bilateralmente para abrir la cavidad torácica. Utilizar el fórceps curvado para comprender el proceso del xiphoid se fija la caja torácica y el corazón está lo suficientemente expuesto.</li>
		<li>Mantener el corazón con otro fórceps curvado suavemente y luego insertar una aguja de 22 G a través del ventrículo izquierdo a la base del arco aórtico.</li>
		<li>Corte la aurícula derecha con unas tijeras finas inmediatamente y luego iniciar la perfusión de sacarosa-ACSF helada, oxigenada a través de un sistema de gravedad. Nota: Transcardial rápido y suficiente perfusión con sacarosa-ACSF helada puede facilitar el rápido enfriamiento de la médula espinal, mientras que la baja concentración de sodio y de calcio puede ayudar a aliviar la toxicidad excitadora y proteger la función neuronal. Además, claro de glóbulos rojos sería beneficioso para la reducción de la tinción de fondo de biocitina al realizar un estudio morfológico. La perfusión se considera suficiente y satisfecho como el líquido que sale de la aurícula derecha es claro y el color del hígado y las patas de la rata es pálido. La punta de la aguja de 22 G debe ser contundente para evitar romper el corazón y el arco aórtico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disección de la médula espinal y rebanar<ol>
<li>Haga una incisión longitudinal (5 cm) en la piel posterior de caudal a rostral, cortan a través de la caja torácica entre la columna vertebral y las costillas a ambos lados en el estado de perfusión.</li>
		<li>Hacer un corte en el extremo caudal de la espina dorsal, use tijeras para cortar los tejidos circundantes y aislar rápidamente el segmento lumbosacro de la columna vertebral.</li>
		<li>Transferir el segmento lumbosacro en un plato de cristal que contienen helado ACSF basada en sacarosa. Con el lado ventral hacia arriba, utilice tijeras finas cortar el pedículo vertebral bilateral y exponer la médula espinal con cuidado. Aislar una médula espinal larga de 2 cm con ampliación sacrolumbar (L1-S3) y transferir la sección espinal a otro plato de cristal llenado de frío sacarosa-ACSF.</li>
		<li>Retire las meninges y la pia-aracnoides membrana debajo de un microscopio de disección. Corte todas las ventrales y dorsales raíces tan pronto como sea posible.</li>
		<li>Lugar de la médula espinal en un bloque de agar previamente recortado. Para preparar rodajas transversales, sujete el lado ventral de la médula espinal para el agar y dejar el lado dorsal hacia la hoja. Para preparar rodajas de parasagittal, sujete el lado ventral con superglue para el agar en dirección vertical como se muestra en la figura 1. A continuación, Monte el bloque de agar a una plataforma de un vibratome con superglue. Preparar 300 – 500 μm transversal o parasagittal rebanadas con una velocidad de avance de 0.025 mm/s y una frecuencia de 80 Hz.</li>
		<li>Use una pipeta de plástico recortado para transferir las rebanadas en malla de nylon en un compartimiento de almacenamiento que contengan ACSF continuamente oxigenada a 32 ° C por al menos 30 min antes de la grabación. Nota: tenga cuidado para evitar lesiones a la médula espinal, especialmente en el cuerno dorsal, al retirar las meninges y las raíces espinales. La médula espinal se debe rebanar dorsal ventral. Para mejores resultados, las láminas deben estar preparadas rápidamente (dentro de 15-20 min). El grosor de un segmento espinal debe ser no más de 600 μm para satisfacer la visibilidad de la célula. Además, la técnica descrita anteriormente podría utilizarse para obtener rodajas horizontales espinales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. celulares Patch-clamp grabaciones
<ol><li>Para llevar a cabo las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la SG, usar K+-basado en la solución intracelular para la mayoría de los casos de grabación, mientras aplica Cs+-solución sólo para la grabación de las corrientes postsinápticas inhibitorias.</li>
	<li>Mueva suavemente un trozo de médula espinal a la sala de grabación y luego mantener con un alambre de platino en forma de U conectados con hilos de nylon firmemente por rebanada óptima estabilidad. Inundar la rebanada con ACSF burbujeado en el RT a través de un sistema de gravedad y ajustar la velocidad de perfusión a 2 – 4 mL/min para lograr la suficiente oxigenación.</li>
	<li>Identificar la región de SG (una banda translúcida) usando un lente de microscopio de baja resolución, elija una neurona sana con el objetivo de alta resolución como la célula diana y ajustar el centro de la pantalla del monitor de vídeo.</li>
	<li>Llene una micropipeta con un volumen adecuado de K+-basado o Cs+-basado en la solución intracelular según sea necesario, introduzca la micropipeta en el soporte del electrodo y asegúrese de que la solución intracelular esté en contacto con el alambre de plata dentro de la titular.</li>
	<li>Traer la micropipeta en foco y sumergir en la ACSF utilizando un micromanipulador y luego aplicar una leve presión positiva (~ 1 psi cuando se mide con un manómetro) para forzar la micropipeta de toda suciedad y desechos.</li>
	<li>Mueva la micropipeta hacia la neurona objetivo gradualmente. Lanzamiento de la presión positiva una vez que la pipeta acerca a la neurona y la forma de una concavidad muy pequeña en la membrana neuronal para formar un gigaseal.</li>
	<li>Alterar la explotación potencial de -70 mV, que es cerca del fisiológico reposo potencial de membrana (RMP) de una célula. Luego, aplica una succión suave y transitoria a la micropipeta para romper la membrana y crear una buena configuración de célula entera. Nota: Después de transferir la rebanada en la cámara de grabación, asegúrese de perfusión constante durante al menos 5 minutos limpiar los escombros en la superficie de la rebanada. Cabe señalar que la capacidad de distinguir entre las neuronas sanas y malsanas o muertos es de importancia primordial para el buen lacre y grabación estable. Una neurona muertas o insalubres tiene un aspecto hinchado o contraído, junto con un núcleo grande visible, mientras que una neurona sana se caracteriza por la forma de 3 dimensiones (3D) con una membrana brillante y suave, y su núcleo es invisible. Para lograr una configuración de celulares, es esencial para compensar la rápida o lenta capacidad de paso a paso cuando sea necesario. A temperatura ambiente, se calcula la ensambladura líquida potencial mV 15.1, 15.2 y 4.3-4.4 mV en K+-basado y Cs+-basado en la solución intracelular, respectivamente. En nuestros estudios, los datos grabados no fueron corregidos para el potencial de Unión líquida.</li>
	<li>Grabaciones de las propiedades intrínsecas de la membrana<ol>
<li>Registrar propiedades pasivas de membrana intrínseca: registro RMP inmediatamente (dentro de 20 s) después. Determinar la resistencia de entrada neuronal mediante la medición de la respuesta de voltaje a una corriente despolarizante (10 pA, 500 ms) en RMP en modo de pinza de corriente.</li>
		<li>Registro de propiedades de la leña: Pruebe el patrón de disparo de cada neurona en la abrazadera de la corriente con una serie de 1 s despolarizantes pulsos actuales (25 – 150 pA con incremento de 25 pA) en el RMP. Medir el umbral, la amplitud y el ancho medio de un solo potencial de acción fuera de línea.</li>
		<li>Registro actual subliminal: para evaluar las corrientes subliminal somáticas, sostenga la membrana potencial a -50 mV en el modo de pinza de voltaje. Luego, aplicar una serie de hiperpolarizantes pulsos de voltaje de 1 duración de s de -60 mV a -120 mV, con un decremento de 10 mV.</li>
		<li>Registrar corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs): registro de EPSCs con K+-intracelular solución en modo de pinza de voltaje en un potencial de explotación de -70 mV.</li>
		<li>Registro IPSCs: Aplicar Cs+-solución intracelular para la grabación de IPSCs. Una vez establecida la configuración de célula entera, sostener la membrana potencial en -70 mV ~ 5 min, y luego cambio la explotación potencial de 0 mV gradualmente. Espere unos minutos para la estabilización y luego empezar a registrar los eventos IPSC. Nota: Sólo las neuronas con una RMP de menos de-50 mV y mostrando overshoot deben seleccionarse para un estudio más profundo. Las resistencias de la serie en nuestro estudio son típicamente 10-30 MΩ, y una grabación debe ser excluida una vez que la resistencia cambia en más del 20%. EPSCs podían ser confirmados con una aplicación de baño de APV de 50 μm y 20 μm CNQX, mientras IPSCs podrían confirmarse con 10 μm bicuculina y estricnina de 1 μm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. morfológico estudio
<ol><li>Para los experimentos morfológicos, uso un K+-basado en la solución intracelular que contiene 0,05% neurobiotin 488.</li>
	<li>Después de mantener una estable por al menos 20 min de grabación electrofisiológica, Retire lentamente la micropipeta en la dirección hacia arriba para permitir que la membrana de la célula sellar y transferir el segmento de la médula espinal a un recipiente llenado con 4% PFA. Arreglar las rodajas en 4% PFA a temperatura ambiente durante 1 hora y luego a 4° C durante la noche.</li>
	<li>Enjuagar las rodajas en PBS y luego sumergirlos en etanol al 50% durante 30 minutos. Después de otro tres lavados en PBS, Monte las rebanadas en su espesor original en diapositivas con un medio de montaje.</li>
	<li>Utilizar un microscopio confocal (véase Tabla de materiales) para la adquisición de imágenes y reconstrucción 3D neuronal. Analizar las neuronas a través de un lente X 20 con una z-pila de 1.5 μm.</li>
</ol>

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<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Este protocolo detalla los pasos para la preparación de rodajas de la médula espinal, que hemos utilizado con éxito cuando se realizan experimentos celulares patch-clamp SG neuronas18,19,20,21. Mediante la aplicación de este método, nos informó recientemente que la minociclina, una segunda generación de la tetraciclina, marcado podría aumentar la transmisión sináptica inhibitoria a través de un...

La sustancia gelatinosa (SG, lámina II del asta dorsal espinal) es un centro de relé sin lugar a dudas importante para la transmisión y regulación de la información sensorial. Se compone de interneurons inhibitorios y excitatorios, que reciben entradas de las fibras aferentes primarias, interneuronas locales y el sistema inhibitorio descendente endógena1. En las últimas décadas, el desarrollo de la preparación de rebanada aguda de la médula espinal y el advenimiento de la grabación de la abrazadera del remiendo de celulares ha permitido varios estudios sobre las propiedades electrofisiológicas y morfológicas intrínsecas del SG neuronas2, 3 , 4 así como los estudios de los circuitos locales en SG5,6. Además, mediante el uso de la preparación de slice en vitro de la médula espinal, los investigadores pueden interpretar los cambios neuronales excitabilities7,8, canales de la función de ion9,10, y actividades sinápticas11,12 en diversas condiciones patológicas. Estos estudios han profundizado nuestra comprensión del papel que juegan las neuronas de la SG en el desarrollo y mantenimiento del dolor crónico y picor neuropático.
Esencialmente, el requisito clave para lograr una clara visualización del soma neuronal y celulares ideal de remiendo usando rebanadas agudo de la médula espinal es para asegurar la calidad excelente de cortes por lo que pueden obtenerse las neuronas sanas y patchable. Sin embargo, preparando láminas medulares implica varios pasos, como realizar una laminectomía ventral y retirar la membrana de la pia-aracnoides, que puede ser obstáculos en la obtención de rodajas saludables. Aunque no es fácil preparar cortes de médula espinal, realizar grabaciones en vitro en segmentos de la médula espinal tiene varias ventajas. En comparación con las preparaciones de cultivo celulares, cortes de médula espinal pueden conservar parcialmente inherentes conexiones sinápticas que están en un estado fisiológicamente relevante. Además, células completas-abrazadera del remiendo realiza una grabación usando segmentos de la médula espinal podría combinarse con otras técnicas, como parche doble abrazadera13,14, estudios morfológicos15,16 y RT-PCR unicelular 17. por lo tanto, esta técnica proporciona más información sobre caracterización de la diversidad anatómica y genética dentro de una región específica y permite la investigación de la composición de circuitos locales.
Aquí, ofrecemos una descripción básica y de detalle de nuestro método para preparar láminas agudas de la médula espinal y la adquisición de grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la SG.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Se utiliza para la preparación de ACSF y PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular basada en ACSF, sacarosa-ACSF y K+</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>Se utiliza para la preparación de ACSF, sacarosa-ACSF y PBS</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Utilizado para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Se utiliza para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Se utiliza para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td></td><td>Sigma G7021</td><td>Se utiliza para la preparación de ACSF</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>Se utiliza para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>A7631</td><td>Utilizado para la preparación de ACSF y sacarosa-ACSF</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td>Utilizado para la preparación de sacarosa-ACSF</td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Wako</td><td>169-11835</td><td>Utilizado para la preparación de solución intracelular basada en K+</td></tr><tr><td>Na2-Fosfocreatina</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular</td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular a base de Cs+</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>Se utiliza para la preparación de solución intracelular a base de Cs+</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td></td><td>Sigma T2265</td><td>Se utiliza para la preparación de soluciones intracelulares a base de Cs+ solución</td></tr><tr><td>Neurobiotina 488</td><td>Vector</td><td>SP-1145</td><td>0.05% neurobiotina 488 podría ser utilizada para estudios morfológicos</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>3% bloque de agar se utilizó en nuestro protocolo</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4% se utilizó paraformaldehído para el procesamiento inmunohistoquímico</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Hengxing Chemical Reactivos</td><td></td><td>utilizados para la preparación de</td></tr><tr><td>PBS Mount Coverslipping Medium</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Urethan</td><td>National Institute for Food and Drug Control</td><td>30191228</td><td>1,5 g/kg, i.p.</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>1,5 mm de diámetro exterior, 1,12 mm de diámetro interno</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Se utiliza para la preparación de micropipetas</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento de vibraciones</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td> <td>infrarrojaDage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de patch-clamp</td><td>Micromanipulador HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>X-Y stage</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR X-Y</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>avanzado</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>PH</td><td>Mettler Microscopio Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Confocol</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia gelatinosa

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Estudios recientes de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) han proporcionado un gran cuerpo de información sobre los mecanismos espinales que transmisión sensorial, regulación nociceptiva y desarrollo crónico de dolor o picazón. Las implementaciones de las grabaciones electrofisiológicas junto con estudios morfológicos basados en la utilidad de rebanadas agudo de la médula espinal han mejorado nuestra comprensión de las propiedades neuronales y la composición de los circuitos locales en SG. Aquí, presentamos a una guía práctica y detallada para la preparación de la médula espinal rebanadas y mostrar representante celulares grabación y resultados morfológicos. Este protocolo permite la preservación neuronal ideal y puede imitar en vivo condiciones hasta cierto punto. En Resumen, la capacidad para obtener una preparación en vitro de segmentos de la médula espinal permite grabaciones estable de fijación de corriente y voltaje y así podría facilitar investigaciones detalladas en las propiedades intrínsecas de la membrana, circuitos locales y estructura neuronal utilizando diferentes aproximaciones experimentales.

Medular aguda rebanadas se prepararon según el esquema mostrado en la figura 1. Después de rebanar y de recuperación, un trozo de médula espinal fue trasladado a la sala de grabación. Se identificaron las neuronas saludables basados en el aspecto de soma usando microscopia de IR-DIC. A continuación, los potenciales de acción de las neuronas de la SG fueron sacados por una serie de despolarización actuales pulsos (1 s de duración) cuando las neuronas se llevar...

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Este método puede ayudar a aclarar los mecanismos espinales subyacentes a la transmisión sensorial, la regulación nociceptiva y el desarrollo del dolor crónico o dolor La principal ventaja de esta técnica es que puede permitir la preservación neuronal ideal y puede imitar las condiciones in-vivo hasta cierto punto. Comience tirando de los electrodos de grabación de microcapilar de vidrio de borosilicato utilizando un tirador capilar. Luego, llene un molde con agar fundido para preparar un bloque de agar de 1,2 centímetros por 1,5 centímetros por 2,0 centímetros.Recorte el bloque para que tenga un canal central si planifica secciones transversales. O una carne de canal con el borde del bloque para secciones parasagitales. Antes de la profusión transcardial y la extracción de la médula espinal, preparar 500 mililitros de SQUI a base de sacarosa.Enfriar la solución al frío y equilibrar con 95%O2 y 5%CO2. Enfríe todas las herramientas de disección en hielo. Haga una incisión longitudinal de cinco centímetros en la piel posterior de caudal a rostral.Luego, corte a través de la caja torácica entre la columna vertebral y las costillas a cada lado. Use tijeras para hacer un corte en el extremo caudal de la columna vertebral. Luego corta los tejidos circundantes y aísla rápidamente el segmento lumbosacral de la columna vertebral.Transfiera el segmento lumbosacral a un plato de vidrio que contenga sacarosa helada a base de ACSF. Con el lado ventral hacia arriba, utilice tijeras finas para cortar a través del pediculo vertebral bilateralmente y exponer la médula espinal cuidadosamente. Aísle una sección de dos centímetros de largo de la médula espinal con el agrandamiento lumbosacral y transfiera la sección espinal a otro plato de vidrio lleno de sacarosa fría ACSF.Trabaje bajo un microscopio de disección para eliminar las meninges y la membrana aracnoides pia. Corta todas las raíces ventrales y dorsales lo más rápido posible. Tenga cuidado de evitar la lejura en la médula espinal, especialmente el cuerno dorsal al retirar las meninges y las raíces espinales.Coloque la médula espinal en el bloque de agar previamente recortado. Para preparar rodajas transversales, une el lado ventral de la médula espinal al agar con el lado dorsal hacia la hoja. Para preparar rodajas parasagittales, une el lado ventral con superpegamento al agar en una dirección vertical.A continuación, monte el bloque de agar en una plataforma de un vibratome con superpegamento. Y prepara rebanadas transversales o parasagitales de 300 a 500 micras con una velocidad avanzada de 0,025 milímetros por segundo y una frecuencia de vibración de 80 hercios. La médula espinal debe ser cortada en rodajas dorso-ventralmente.Para obtener los mejores resultados, la rebanada debe prepararse en un plazo de 15 a 20 minutos. El grosor de la rodaja espinal no debe ser superior a 600 micras para satisfacer la visibilidad celular. Utilice una pipeta recortada de plástico para transferir las rodajas a la malla de nylon en una cámara de almacenamiento que contenga ACSF continuamente oxigenado a 32 grados centígrados.Para llevar a cabo grabaciones de abrazaderas de parches de células enteras a partir de neuronas de sustancia gelatinosa o SG, utilice soluciones intracelulares basadas en iones de potasio para el registro mientras aplique una solución basada en cationes de cesio solo para el registro de corrientes postsinápticas inhibitorias. Mueva suavemente la rodaja de la médula espinal a la cámara de grabación. Y luego estabilizarlo firmemente con un alambre de platino en forma de U con hilos de nylon para una estabilidad óptima de la rebanada.Profusa constantemente la rebanada con ACSF burbujeado a temperatura ambiente y ajuste la velocidad de profusión en dos a cuatro mililitros por minuto para lograr suficiente oxigenación. Luego, usando una lente de microscopio de baja resolución, identifique la región de las neuronas SG como una banda translúcida. Elija una neurona sana, caracterizada por una forma tridimensional con una membrana brillante y lisa como la célula objetivo utilizando el objetivo de alta resolución y ajústela al centro de la pantalla del monitor de vídeo.Llene una micro pipeta con un volumen adecuado de solución intracelular basada en iones de potasio o iones de cesio. A continuación, inserte la microtutilla en el soporte del electrodo y asegúrese de que la solución intracelular está en contacto con el cable de plata dentro del soporte. Ponga la micro pipeta en el foco y utilice el micromanipulador para sumergirla en el ACSF.Aplique una presión positiva suave para forzar la eliminación de la suciedad y los escombros. Mueva gradualmente la micro pipeta hacia la neurona objetivo. Una vez que la pipeta se acerca a la neurona y se forma un hoyuelo muy pequeño en la membrana neuronal, libere la presión positiva para formar un gigaseal.Alterar el potencial de retención a menos 70 milivoltios, que está cerca del potencial de membrana de reposo fisiológico de una célula. A continuación, aplique una succión transitoria y suave a la micro pipeta para romper la membrana y crear una buena configuración de células enteras. Registre las propiedades de disparo probando el patrón de disparo de cada neurona en la abrazadera de corriente con una serie de pulsos de corriente despolarizante de un segundo de 25 a 150 picoamps con 25 incrementos de picoamp en el potencial de membrana en reposo.Para registrar corrientes somáticas de subtarea, mantenga el potencial de membrana en menos 50 milivoltios en modo de abrazadera de voltaje y luego aplique una serie de pulsos de voltaje hiperpolarising de una segunda duración de menos 60 milivoltios a menos 120 milivoltios con un decremento de 10 milivoltios. Registre corrientes postsinápticas excitatorias con la solución intracelular basada en iones de potasio en modo de abrazadera de voltaje con un potencial de retención de menos 70 milivoltios. Registre ipSC utilizando la solución intracelular basada en ion de cesio para registrar IPSC.Después de mantener el potencial de membrana en menos 70 milivoltios durante aproximadamente cinco minutos, cambie gradualmente el potencial de retención a cero milivoltios. Espere unos minutos para la estabilización y después comience a registrar los eventos IPSC. Los patrones de disparo determinados mediante la inyección de una serie de pulsos de corriente despolarizante de una segunda en una neurona SG en el potencial de membrana en reposo pueden clasificarse como disparo tónico, disparo retrasado, disparo de huecos, ráfaga inicial, ráfaga fásica, disparo de un solo pico y disparo a regañadientes.Esta imagen muestra el protocolo de evocación para las corrientes de subtrano en la abrazadera de voltaje. Estos rastros representativos muestran la respuesta a la inyección de corriente hiperpolarizante clasificada como IH, IA y TI. Este es un rastro representativo de SEPSC registrado a partir de neuronas SG a menos 70 milivoltios en ausencia y presencia de 50 micromolares APV y 20 micromolarES CNQX. Esta traza muestra los SEPC registrados antes de la adición de APV y CNQX en una escala de tiempo ampliada.Siguiendo este procedimiento son los métodos como las grabaciones de abrazaderas de parches emparejados o la optogenética se pueden realizar para responder preguntas adicionales como la caracterización de microcircuitos neuronales específicos en la sustancia gelatinosa.

preparation-acute-spinal-cord-slices-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Este video muestra una técnica para el registro de patch-clamp desde la superficie de la membrana dendrítica. Esto ayuda a examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos subyacentes dependientes de voltaje en las neuronas dopaminérgicas.

Grabaciones de patch-clamp de la dendrita de una neurona dopaminérgica en un corte de cerebro

Este video muestra el procedimiento para realizar registros electrofisiológicos en neuronas de sustancia gelatinosa (SG) de cortes de médula espinal, utilizando técnicas de patch-clamp de células enteras para analizar los patrones de disparo de las neuronas. Este método permite el estudio de las respuestas neuronales a estímulos en las neuronas SG de la médula espinal.

Registro de pinza de parche de célula entera en una neurona gelatinosa de una sustancia de un corte de médula espinal

El registro de las corrientes de Ca2+ en la membrana frontal de liberación presináptica es clave para una comprensión precisa de la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores. Presentamos una disociación aguda de la médula espinal de la lamprea que produce axones reticuloespinales aislados funcionales, lo que permite el registro directo desde la membrana de la cara de liberación de las terminales presinápticas individuales.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Aquí, se presenta un procedimiento para activar selectivamente una proteína neuronal con un pulso corto de luz mediante la codificación genética de un aminoácido no natural foto-reactivo en una proteína neuronal diana expresada en neuronas en cultivo o in vivo.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Los registros subcelulares de patch-clamp ofrecen la posibilidad de investigar las propiedades funcionales de las dendritas. Sin embargo, estas finas estructuras no son fácilmente accesibles debido a su pequeño diámetro. El protocolo aquí descrito tiene como objetivo facilitar la recopilación de registros estables y fiables de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en cortes in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Presentamos un protocolo para preparar rodajas agudas del hipocampo dorsal-intermedio de ratones. Comparamos esta preparación transversal con el corte coronal en términos de calidad de las grabaciones y preservación de las características morfológicas de las neuronas grabadas.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Aprende a preparar láminas agudas de médula espinal para grabaciones patch-clamp en neuronas de la sustancia gelatinosa. Este método permite estudiar propiedades electrofisiológicas y mecanismos del dolor crónico.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa (Video) | JoVE Journal

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

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