Name: Un pequeño ARN no codificante MicC contribuye a la virulencia en las proteínas de la membrana externa en Salmonella enteritidis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprende a crear mutantes de deleción del ARN no codificante micC en Salmonella enteritidis mediante recombinación homóloga. Este método eficiente facilita el estudio de funciones génicas y el desarrollo de candidatos vacunales atenuados.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nos. 31972651 y 31101826), la Fundación de Ciencias de Educación Superior de Jiangsu (No.14KJB230002), el Laboratorio Estatal Clave de Biotecnología Veterinaria (No.SKLVBF201509), la Subvención de la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de Yangzhou (No.YZ2014019), un proyecto financiado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD).

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. El comité de cuidado y uso de animales de la Universidad de Yangzhou aprobó todos los experimentos y procedimientos aplicados a los animales (SYXK2016-0020).
1. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo
<ol><li>Utilice las bacterias y plásmidos enumerados en la Tabla 1.</li>
	<li>Cultivar bacterias en caldo LB o en placas de agar LB a 37 °C, en presencia de 50 μg/ml de ampicilina (Amp) cuando proceda.</li>
	<li>Las cepas de cultivo que contienen plásmidos sensibles a la temperatura se utilizan para la construcción de mutantes de deleción a 30 °C.</li>
</ol>2. Clone micC gene of S. Enteritidis cepa 50336
<ol><li>Basado en la secuencia aguas arriba y aguas abajo del gen micC de S. Typhimurium cepa SL1344, diseñan cebadores vmicC-F y vmicC-R para amplificar un fragmento que contiene el gen micC mediante PCR utilizando ADN genómico SE50336 como plantilla.</li>
	<li>Mezclar 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebadores vmicC-F y vmicC-R, respectivamente, 5 μL de plantilla, 1 μL de ADN polimerasa Taq y 35 μL deddH2Ojuntos para PCR.</li>
	<li>Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 53 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.</li>
	<li>Secuenciar el producto de PCR para obtener la secuencia del gen micC .</li>
</ol>3. Construcción del mutante de deleción micC
NOTA: El mutante micC negativo de Salmonella Enteritidis cepa 50336 se construyó utilizando la recombinación mediada por λ-Red como se describió anteriormente13,14. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 2.
<ol><li>Amplificar el casete de cloranfenicol que contiene fragmentos de homología del gen micC .<ol><li>Diseñar cebadores micC-F y micC-R para amplificar el casete de cloranfenicol (Cm) a partir del plásmido pKD3, incluidas extensiones de homología de 50 pb del gen 5' y 3' del gen micC .</li>
		<li>Extraiga el plásmido pKD3 como plantilla de PCR.</li>
		<li>Mezclar 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebadores micC-F y micC-R, respectivamente, 5 μL de plantilla, 1 μL de ADN polimerasa Taq y 35 μL deddH2Ojuntos como mezcla de reacción de PCR</li>
		<li>Amplificar el casete Cm con las siguientes condiciones de reacción por PCR: predesnaturalización a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 1 min, 52 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 10 ciclos; 94 °C durante 1 min, 63 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.</li>
		<li>Detectar el tamaño del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Purificar y recuperar el producto de PCR con el kit de recuperación de gel de ADN, y determinar la concentración de ADN por espectrofotómetro. PRECAUCIÓN: La PCR debe realizarse dos veces. El primer producto de PCR se diluyó en una proporción de 1:200 y se utilizó como plantilla para la PCR secundaria, para eliminar la interferencia de una mayor recombinación por el plásmido pKD3.</li>
	</ol></li>
	<li>Construct1st recombinant strain 50336ΔmicC::cat
	<ol><li>Mezclar 100 μL de células competentes SE50336 con 5 μL de plásmido pKD46 uniformemente e incubar en hielo durante 30 min. Golpee térmicamente la mezcla anterior a 42 °C durante 90 s y transfiera rápidamente la mezcla al hielo durante 2 minutos para transformar el plásmido pKD46 a SE50336. Detectar colonias positivas cultivando durante la noche a 30 °C en una placa resistente a amperios (50 μg/ml).</li>
		<li>Añadir 30 mM de L-arabinosa al cultivo líquido SE50336/pKD46 e inducir la expresión de recombinasa mediante un cultivo de agitación a 30 °C durante 1 h. Luego prepare células competentes.</li>
		<li>Mezcle 100 ng de producto de PCR purificado (paso 3.1) y 40 μL de células competentes SE50336/pKD46 en una taza de descarga eléctrica (por ejemplo, Bio-Rad). Realice la transformación de descargas eléctricas con los parámetros de voltaje 1.8 kV, pulso 25 μF y resistencia 200 Ω.</li>
		<li>Después de la electrotransformación, transferir la mezcla a 1 ml de medio SOC y un cultivo de agitación a 150 rpm y 30 °C durante 1 h. Luego unte la mezcla en una placa LB resistente a Cm (34 μg / ml) y cultive a 37 ° C durante la noche para detectar colonias positivas.</li>
		<li>Cultivar la colonia positiva anterior a 42 °C durante 2 h. Cribar la colonia sensible a Amp (50 μg/mL) pero resistente a Cm (34 μg/mL) a 37 °C durante la noche para obtener la 1ª cepa recombinante sin pKD46.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificar la 1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::Cat.<ol><li>Extraiga 50336ΔmicC::ADN genómico de Cat como plantilla de PCR. Utilice los mismos componentes de reacción de PCR que en el paso 2.1. Realizar la reacción de PCR en las mismas condiciones que en el paso 2.1.</li>
		<li>Detectar el tamaño del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y secuenciar el producto de PCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Construir deleción mutante 50336ΔmicC.
	<ol><li>Electroporar 100 ng de plásmido pCP20 en 40 μL de 50336ΔmicC::Células competentes Cat con los parámetros de tensión 1,8 kV, pulso 25 μF y resistencia 200 Ω, cribar transformadores positivos en placas resistentes a Amp (50 μg/mL) y Cm (34 μg/mL) a 30 °C.</li>
		<li>Transfiera los transformadores positivos por encima de los transformadores a LB no resistentes y crípelos durante la noche a 42 °C, y luego aísle colonias individuales en una placa de LB a 37 °C. Seleccione la colonia que sea sensible tanto a Amp como a Cm. Este mutante es el mutante de deleción micC SE50336ΔmicC.</li>
		<li>Verifique 50336ΔmicC por PCR.<ol><li>Extraer ADN genómico 50336ΔmicC como plantilla de PCR. Mezclar 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebador vmicC-F, 1 μL de cebador vmicC-R, 5 μL de plantilla, 1 μL de ADN polimerasa Taq y 35 μL deddH2Ojuntos para PCR.</li>
			<li>Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 53 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Construcción de la cepa complementada micC
<ol><li>Diseño de imprimaciones pBR-micC-F y pBR-micC-R con sitios de restricción NheI y SalI.<ol><li>Amplificar el gen micC de longitud completa con secuencias de flanco utilizando una mezcla de reacción de PCR que contiene 5 μL de ADN genómico SE50336 como plantilla, cebadores 1 μL de pBR-micC-F y 1 μL de pBR-micC-R como cebadores, 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla dNTP (2.5 mM), 2 μL de mezcla dNTP (2.5 mM) y 35 μL deddH2O.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 52 °C durante 50 s, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min. Purificar y recuperar el producto de PCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Digerir el producto PCR y el plásmido pBR322 respectivamente utilizando la enzima de restricción NheI y SalI, y ligarlos usando T4 ligasa a 16 °C durante la noche para obtener el plásmido pBR322-micC.</li>
	<li>Transformar pBR322-micC en las células competentes SE50336ΔmicC y detectar el transformador positivo para obtener la cepa complementaria SE50336ΔmicC/pmicC. Extraer el plásmido pBR322-micC de la cepa complementada y verificarlo mediante digestión y secuenciación de enzimas de restricción.</li>
</ol>5. Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real
<ol><li>Cultivo SE50336, 50336ΔmicC y 50336ΔmicC/pmicC en medio LB durante la noche a 24 °C con 180 rpm cultivo de agitación a un OD600 de 2.0. Recolectar el cultivo bacteriano por centrifugación a 13000 rpm durante 2 min.</li>
	<li>Extraer ARN total utilizando el reactivo TRIzol. Incubar 50 μL de ARN aislado con 2 μL de DNasa I y 6 μL de tampón 10x a 37 °C durante 30 min para eliminar el ADN. Determinar la cantidad de ARN pipeteando 1 μL de muestra de ARN a un microespectrofotómetro.</li>
	<li>Síntesis de ADNc<ol><li>Utilice 1 μg de ARN total para la síntesis de ADNc en 20 μL del sistema de reacción de transcripción inversa (4 μL de tampón 5x, 1 μL de mezcla de enzimas RT, 1 μL de mezcla de cebador RT, 10 μL de ARN total y 4 μL deddH2O). Incubar por encima del sistema de reacción a 37 °C durante 15 min y luego a 85 °C durante 5 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseño de cebadores basados en la secuencia de genes diana ompA, ompC y ompD. Realice la PCR con transcripción inversa utilizando un kit de reactivos RT. Los componentes de la reacción de PCR contienen 2,5 μLde de tampón de reacción de PCR 10x, 1 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebadores del gen diana (ompA, ompC u ompD), 2,5 μL de plantilla, 0,5 μL de ADN polimerasa Taq y 17,5 μL de ddH2O.<ol><li>Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar PCR en tiempo real utilizando el kit RT-PCR verde SYBR en un instrumento RT-PCT por triplicado.<ol><li>Utilice los siguientes componentes de reacción de PCR: 10 μL de 2x tampón SYBR, 0,4 μLde cebador directo y cebador inverso respectivamente, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μLde de ADNc y 6,8 μL deH2Olibre de RNasa.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: predesnaturalización a 95 °C durante 1 minuto durante un ciclo; 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 34 s durante 40 ciclos.</li>
		<li>Normalizar todos los datos al gen de referencia endógeno gyrA. Utilizar el método 2-ΔΔCT para la cuantificación de los datos15.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Ensayos de virulencia
<ol><li>Cultivo SE50336, 50336ΔmicC y 50336ΔmicC/pmicC en LB fase estacionaria media a temprana (OD600 de 2-3) a 24 °C, cosecha por centrifugación y diluir a CFU mL-1 apropiado en PBS estéril.</li>
	<li>Para infecciones en ratones, diluir las cepas cultivadas a 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL y 103 UFC/200 μL de gradiente de resuspensiones. Infectar grupos de cinco ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad por cepa mediante inyección subcutánea. Inyectar el grupo control con 200 μL de solución salina fisiológica.</li>
	<li>Para infecciones de pollo, diluir por encima de tres cepas a 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL y 109 UFC/200 μL de gradiente de resuspensiones. Infectar grupos de veinte pollos de 1 día de edad por cepa mediante inyección subcutánea.</li>
	<li>Monitoree diariamente los signos de enfermedad y muertes de animales de experimentación. Calcular la DL50 (dosis letal mediana) 14 días después de la infección como se describió anteriormente16. Procesar los datos utilizando un software de análisis de datos.</li>
	<li>En los grupos de infección, recolecte el corazón, el hígado, el bazo, el pulmón y el riñón de los pollitos recién muertos. Pese 0,5 g de los tejidos anteriores por separado y muélalos con una operación estéril. Diluir las muestras de molienda gradualmente, extenderlas en la placa LB y cultivar durante 8-10 h a 37 °C. Registrar la cantidad de cepas de Salmonella colonizadas en los tejidos de los pollitos.</li>
</ol>

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<li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li>
<li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboregulation+in+Escherichia+coli%3A+DsrA+RNA+acts+by+RNA%3ARNA+interactions+at+multiple+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li>
<li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C%2FA-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li>
<li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li>
<li>Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

S. La enteritidis es un importante patógeno intracelular facultativo que puede infectar pollos jóvenes y produce síntomas desde enteritis hasta infección sistémica y muerte17,18. Además, S. enteritidis causa infecciones latentes en pollos adultos y los portadores crónicos contaminan los productos avícolas, lo que resulta en infecciones transmitidas por los alimentos en humanos19. El mecanismo patogénico de S. ent...

Los ARN pequeños no codificantes (ARNs) tienen una longitud de 40-400 nucleótidos, que generalmente no codifican proteínas, pero podrían transcribirse independientemente en cromosomas bacterianos 1,2,3. La mayoría de los ARNs están codificados en las regiones intergénicas (IGR) entre las regiones codificantes de genes e interactúan con los ARNm diana a través de acciones de apareamiento de bases, y regulan la expresión de genes diana a nivel post-transcripcional 4,5. Desempeñan importantes funciones de regulación en el metabolismo de sustancias, la síntesis de proteínas de la membrana externa, la detección de quórum y la expresión génica de virulencia5.
MicC es un pequeño transcrito de ARN de 109 nucleótidos presente en Escherichia coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium, que podría regular la expresión de múltiples proteínas de membrana externa como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 y Omp36 6,7,8,9. MicC regula la expresión de OmpC inhibiendo la unión del ribosoma al ARNm de ompC líder in vitro y requiere la chaperona de ARN Hfq para su función en Escherichia coli6. En Salmonella Typhimurium, MicC silencia el ARNm ompD a través de un ARN dúplex de ≤12 pb dentro de la secuencia codificante (codones 23-26) y luego desestabiliza el ARNm endonucleolítico7. Este proceso de regulación es asistido por la proteína chaperona Hfq10. La OmpC es una proteína abundante de la membrana externa que se pensaba que era importante en ambientes donde las concentraciones de nutrientes y toxinas eran altas, como en el intestino6. La porina OmpD es la proteína de la membrana externa más abundante en Salmonella Typhimurium y representa aproximadamente el 1% de la proteína celular total11. OmpD está implicado en la adhesión a macrófagos humanos y células epiteliales intestinales12. MicC también reprime la expresión de las porinas OmpC y OmpD. Se cree que MicC puede regular la virulencia. Para explorar nuevos genes diana regulados por MicC y estudiar la función de regulación de virulencia de micC, clonamos el gen micC en la cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE), y luego construimos el mutante 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/p micC. Los nuevos genes diana fueron examinados por qRT-PCR. La virulencia de 50336ΔmicC fue detectada por infecciones de ratones y pollos.

<table><tbody><tr><td>dextrosa</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610219</td><td>para la preparación de caldos</td></tr><tr><td>kit de purificación de ADN</td><td>TIANGEN</td><td>DP214</td><td>para la purificación de ADN</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR01A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Reactivo Químico</td><td>10017608</td><td>para la preparación de caldos</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sinopharm Reactivo Químico</td><td>20032116</td><td>para la preparación de caldos</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610071</td><td>&lambda;-Red recombinación</td></tr><tr><td>de rojo Mini Kit de plásmido</td><td>TIANGEN</td><td>DP106</td><td>extracción de plásmidos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Reactivo Químico</td><td>10019308</td><td>para la preparación</td></tr> <tr><td>de caldos(NH4)2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10002917</td><td>para la preparación de caldos</td></tr><tr><td>PrimeScriptRRT Kit de reactivos con borrador de ADNg&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR047</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBRR Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>Ligadura</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>para la preparación de caldo</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>para la preparación de caldo</td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>centrifugación</td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Electroforesis</td></tr><tr><td>&nbsp; Sistema de electroporación</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td>para la transformación bacteriana</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>BioTek</td><td>Epoch</td><td>Detección de absorbancia</td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Sistema Applied Biosystems</td><td>7500</td><td>qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

un pequeño arn no codificante micc contribuye a la virulencia en las proteínas de la membrana externa en salmonella enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Un ARN pequeño no codificante (ARNs) es un nuevo factor para regular la expresión génica a nivel post-transcripcional. Un tipo de sRNA MicC, conocido en Escherichia coli y Salmonella Typhimurium, podría reprimir la expresión de proteínas de la membrana externa. Para investigar más a fondo la función de regulación de micC en Salmonella Enteritidis, clonamos el gen micC en la cepa 50336 de Salmonella Enteritidis, y luego construimos el mutante 50336Δ micC mediante el sistema de recombinación λ de base roja y el mutante complementario 50336Δ micC/p micC portador del plásmido recombinante pBR322 que expresa micC. Los resultados de qRT-PCR demostraron que la transcripción de ompD en 50336Δ micC fue 1,3 veces mayor que en la cepa de tipo salvaje, mientras que la transcripción de ompA y ompC en 50336Δ micC fue 2,2 veces mayor y 3 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje. Estos indicaron que micC reprime la expresión de ompA y ompC. En el siguiente estudio, la patogenicidad de 50336ΔmicC se detectó infectando ratones Balb/c de 6 semanas de edad y pollos de 1 día de edad. El resultado mostró que la LD 50 de la cepa de tipo salvaje 50336, los mutantes 50336Δ micC y 50336Δ micC / p micC para ratones Balb / c de 6 semanas de edad fueron 12.59 UFC, 5.01 UFC y 19.95 UFC, respectivamente. Las DL 50 de las cepas para pollos de 1 día de edad fueron 1.13 x 109 UFC, 1.55 x 10 8 UFC y2.54 x 10 8 UFC, respectivamente. Indicó que la eliminación de micC aumentaba la virulencia de S. Enteritidis en ratones y pollos mediante la regulación de la expresión de proteínas de la membrana externa.

Construcción del mutante 50336Δ micC y cepa complementada 50336Δ micC /p micC El resultado del clon del gen micC indicó que este gen estaba compuesto por 109 pb mostrando una identidad del 100% con la de S. Typhimurium. Con base en los datos de secuencia, el mutante de deleción 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/pmicC </...

Se utilizó un sistema de recombinación mediado por λ-Red para crear un mutante de deleción de un pequeño micC de ARN no codificante.

Un pequeño ARN no codificante MicC contribuye a la virulencia en las proteínas de la membrana externa en Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Este protocolo se puede utilizar para inactivar genes cromosómicos para aislar mutantes para el estudio de la función génica y bacterias. Hace que el proceso de recombinación homólogo sea simple, rápido y altamente eficiente. Usando esta técnica, los genes relacionados con la virulencia del patógeno se pueden eliminar para obtener el mutante atenuado que se puede utilizar como candidato para la vacuna atenuada.Comience por amplificar el casete de cloranfenicol que contiene fragmentos de hemología del gen micC. Diseñar cebadores directos e inversos para amplificar el casete de cloranfenicol del plásmido PKD3, incluidas 50 extensiones de homología de pares de bases de los cinco extremos primos y tres primarios del gen micC. Realizar PCR como se describe en el texto manuscrito utilizando el plásmido PKD3 como plantilla para amplificar el casete de cloranfenicol.Determine el tamaño del producto de PCR con electroforesis en gel de agarosa. Luego purifique el producto con un kit de recuperación de gel de ADN y determine la concentración de ADN por espectrofotometría. Llevar a cabo una segunda reacción de PCR para eliminar la interferencia de una mayor recombinación por el plásmido PKD3.Diluir el primer producto de PCR en una proporción de 1 a 200 y utilizarlo como plantilla para la PCR secundaria. Para construir la primera cepa recombinante 50336 delta micC dot cat, mezcle 100 microlitros de células competentes SE 50336 con cinco microlitros de plásmido PKD 46 e incube en hielo durante 30 minutos. Golpee la mezcla a 42 grados centígrados durante 90 segundos y transfiérala rápidamente sobre hielo durante dos minutos para transformar el plásmido en las células.Detectar colonias positivas cultivando las células durante la noche a 30 grados centígrados en una placa resistente a la ampicilina. Al día siguiente, agregue 30 mili más de L de arabinosa al cultivo líquido SE 50336 PKD 46 e induzca la expresión de recombinasa con una incubación de una hora a 30 grados centígrados mientras agita. Mezcle 100 nanogramos del producto de PCR purificado y 40 microlitros de células competentes SE 50336 PKD 46 en una taza de descarga eléctrica.Luego lleva a cabo la transformación de descargas eléctricas. Después de la electrotransformación, transfiera la mezcla a un mililitro de medio SOC y una incubadora de cultivo de agitación a 150 RPM y 30 grados centígrados durante una hora. Extienda la mezcla en una placa LB resistente al cloranfenicol y cultive a 37 grados centígrados durante la noche para detectar colonias positivas.Cultive las colonias positivas a 42 grados centígrados durante dos horas. Luego examine la colonia para detectar sensibilidad a la ampicilina y resistencia al cloranfenicol a 37 grados centígrados durante la noche para obtener la primera cepa recombinante sin PKD 46. Después de extraer el ADN genómico 50336 Delta micC dot cat mediante PCR y electroforesis en gel, electroplatee 100 nanogramos del plásmido PCP 20 en 40 microlitros de 50336 Delta micC dot cat competent cells.Cribe transformadores positivos en placas resistentes a ampicilina y cloranfenicol a 30 grados centígrados. Transfiera los transformadores positivos a un medio líquido LB no resistente y pérelos durante la noche a 42 grados centígrados. Luego aísle colonias individuales en una placa LB a 37 grados centígrados.Seleccione la colonia que sea sensible tanto a la ampicilina como al cloranfenicol. Este mutante es el mutante de deleción micC SE 50336 Delta micC. Verifique 50336 Delta micC realizando PCR como se describe en el texto manuscrito.Este protocolo se utilizó para construir el mutante de deleción 50336 Delta micC en el mutante complementario 50336 Delta micC, pmicC. El primer gato 50336 Delta micC dot recombinante se validó mediante PCR con un tamaño de banda esperado de aproximadamente 1200 pares de bases de productos de PCR con la inserción de cloranfenicol en comparación con 279 pares de bases en la cepa de tipo salvaje. En la segunda recombinación, el casete de cloranfenicol fue eliminado por PCP 20.Los resultados de la PCR combinados con la secuenciación confirmaron que el mutante isogénico micC se construyó con éxito. La expresión de los genes ompA, ompC y ompD en las cepas 50336, 50336 Delta micC y 50336 delta micC pmicC se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La transcripción de ompA y ompC y 50336 delta micC aumentó aproximadamente 2,2 veces y tres veces en comparación con la cepa de tipo salvaje.Mientras que la transcripción de ompD solo aumentó ligeramente. Los ensayos LD 50 mostraron que después de infectar ratones BALB/c de seis a ocho semanas de edad con cada una de las tres cepas, la mayoría de los ratones infectados por 50336 Delta micC mostraron lasitud, inapetencia o diarrea 48 horas después de la infección y murieron después de 96 horas. Los ratones infectados por cepa de tipo salvaje y 50336 delta micC pmicC mostraron los mismos síntomas 72 horas después de la infección y murieron después de 120 horas.Los LD 50 de las tres cepas indicaron que la virulencia del mutante 50336 Delta micC mejoró 2,5 veces en comparación con el tipo salvaje. Esta técnica ayuda a los investigadores a estudiar la función de los genes bacterianos y obtener la cepa de ingeniería deseada mediante la eliminación de genes objetivo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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