Name: Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a detectar Candidatus Liberibacter asiaticus en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa con CRISPR-Cas12a. Este método portátil ofrece alta sensibilidad para diagnosticar Huanglongbing en cítricos en solo 90 minutos.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFD1400805), el Programa Principal de Investigación y Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Jiangxi (20194ABC28007), Proyectos del Departamento de Educación de Jiangxi (GJJ201449) y la Innovación Colaborativa de Investigación Científica Agrícola Moderna en la Provincia de Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

1. Construcción del CLas-DETECTR
NOTA: La construcción de CLas-DETECTR es un proceso de cuatro pasos: preparación de la solución, aislamiento de ADN total cítrico, amplificación isotérmica del ADN y visualización de resultados. El esquema del ensayo CLas-DETECTR se ilustra en la Figura 1A.
<ol><li>Preparación de la solución<ol><li>Preparar el tampón A: 20 mM NaOH en 6% PEG 200. Para 100 ml, agregue 113 mg de NaOH y 6 g de PEG 200 en 80 ml deH2Oen una botella. Incubar el frasco en un baño maría a 60 °C hasta que se disuelva todo el PEG 200. Luego, agregueH2Oa un volumen de 100 ml.</li>
		<li>Preparar la solución B: Para cada reacción, añadir 10 μL de tampón RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr y 3,9 μL deddH2Oa un volumen final de 15,5 μL. NOTA: F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr son los cebadores utilizados en el ensayo contra el gen nrdB . Consulte la Tabla 1 para la secuencia.</li>
		<li>Preparar la solución C: Para cada reacción, añadir 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampón NEB 3.1, 1 μL de crRNA, 4 μL de Cas12a y 11 μL deddH2Oa un volumen final de 20 μL. NOTA: Si hay muchas muestras para detectar, haga un gran volumen de solución B y solución C, y alícuota más tarde.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de ADN total de cítricos NOTA: Para ahorrar tiempo y hacer que este método sea adecuado para la detección de CLas de campo, se utilizó el enfoque basado en polietilenglicol alcalino (PEG) para obtener extractos de plantas crudas para la amplificación de ADN22,23<ol><li>Las hojas de cítricos se utilizaron en este protocolo. Primero, perfore cinco discos de hojas de una hoja. A continuación, coloque los discos de hoja en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agregue 200 μL de tampón A. NOTA: En el campo, limpie las hojas primero si hay polvo cubriéndolas. Los discos de las hojas se pueden recortar utilizando la tapa del tubo de 1,5 ml para evitar la contaminación cruzada. Otros tejidos cítricos, como raíces, tallos, frutas y flores, también se pueden usar en este protocolo.</li>
		<li>Moler los discos de hojas manualmente hasta que queden suaves con una varilla de plástico.</li>
		<li>Deje el tubo sin molestias durante 10 minutos. Luego, use el sobrenadante para la amplificación del ADN. NOTA: El ensayo se puede pausar aquí, y los extractos de plantas crudas que se extrajeron por el método alcalino-PEG se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 1 año. Los árboles de naranja dulce Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) que se muestran en el video se cultivaron en una maceta llena de una mezcla de tierra de turba / vermiculita / perlita 9/3/1 (v / v / v) y se mantuvieron en un invernadero ubicado en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. Los árboles infectados con HLB fueron inoculados por injerto con brotes de Newhall positivos para CLas. Los árboles infectados con HLB y no infectados con HLB fueron confirmados por PCR. CLas se detectó utilizando el par de cebadores (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) dirigido al gen marcador específico de CLas nrdB. Por otro lado, los síntomas característicos de HLB, moteado con manchas y hojas amarillentas se pueden encontrar en árboles CLas-positivos pero no en CLas-negativos.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificación isotérmica del ADN<ol><li>Añadir 1 μL del sobrenadante de la etapa 1.2.3 y 1 μL de MgOAc (concentración final de 14 mM) en la solución B y mezclar bien.</li>
		<li>En el laboratorio, incubarlos en una incubadora simple a 37 °C durante 15 min. NOTA: En el campo, sostenga los tubos en la mano durante 15 minutos. También se sugiere incubar tubos en una incubadora simple a 37 °C durante 15 min si las condiciones lo permiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualización de resultados<ol><li>Añadir 10 μL de la mezcla del paso 1.3.2 en la solución C y mezclar bien.</li>
		<li>Incubarlos en una incubadora a 37 °C durante 60 min.</li>
		<li>Use gafas y observe la señal de fluorescencia verde liberada por el reportero ssDNA etiquetado con 5' 6-fluoresceína a 5' y el apagador de fluorescencia a 3' a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil (longitud de onda de excitación: 440 nm, longitud de onda de emisión: 500 nm). NOTA: la señal de fluorescencia verde puede durar varios días, es mejor PRECAUCIÓN: La luz emitida por el dispositivo de detección de fluorescencia es perjudicial para los ojos. Asegúrese de usar gafas antes de observar los resultados.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Prueba de especificidad
NOTA: Para probar la especificidad de CLas-DETECTR, la bacteria de la rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) y Burkholderia stabilis cepa 1440 aislada en el laboratorio24 se sometieron a la prueba CLas-DETECTR.
NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) no se puede cultivar. Solo se puede obtener ADN CLas a partir de la extracción de ADN genómico de tejidos cítricos infectados con CLas. Xcc es el agente causal de otra importante enfermedad de los cítricos, el cancro de los cítricos. Burkholderia stabilis cepa 1440 es una bacteria anti-Xcc aislada en el laboratorio. Por lo tanto, se utilizaron cepas puras para estas tres bacterias.
<ol><li>Extraiga el ADN genómico bacteriano (ADNg) utilizando un kit de extracción de ADN genómico bacteriano siguiendo el protocolo del fabricante. Use el agua como un control negativo.</li>
	<li>Realizar PCR utilizando tiras de tubo de PCR de 0,2 ml con tapas ópticas en una mezcla de reacción de 25 μL que contiene 1 μL de F-RPA-RNRf, 1 μL de R-RPA-RNRr, 12,5 μL de Ex Taq Versión 2.0 más colorante, 1 μL de plantilla de ADN y 9,5 μL deH2O.<ol><li>Utilice las siguientes condiciones de reacción de ciclo térmico: 1 min a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C y 15 s a 72 °C; luego 10 min a 72 °C; y mantener a 16 °C.</li>
		<li>Ejecute los productos de PCR en gel de agarosa al 1% a 120 V durante 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar qPCR en una mezcla de reacción de 20 μL que contiene 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr, 10 μL de 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL de la plantilla de ADN y 7,4 μL deH2O.<ol><li>Utilice las siguientes condiciones de reacción de ciclo térmico: 30 s a 95 °C; seguido de 45 ciclos de 5 s a 95 °C y 32 s a 60 °C; y luego una etapa de curva de fusión de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C y 15 s a 95 °C.</li>
		<li>Incluye tres repeticiones técnicas en cada repetición.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice el método CLas-DETECTR siguiendo los pasos 1.1–1.4.</li>
</ol>3. Comparación de sensibilidad
<ol><li>Para probar la sensibilidad de CLas DETECTR, detecte una serie de diluciones de fragmentos de ADN de CLas utilizando PCR, CLas-DETECTR y qPCR, como se describió anteriormente.</li>
	<li>Amplificar un segmento de ADN con una longitud de 1.060 pb a partir de nrdB utilizando el conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR en una mezcla de reacción de 100 μL que contenga 4 μL de F-RNR, 4 μL de R-RNR, 50 μL de PrimeSTAR Max Premix, 2 μL de plantilla de ADN y 40 μL deH2O, siguiendo las condiciones de reacción de ciclo térmico (30 s a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C), 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; luego 10 min a 72 °C; y mantener a 16 °C). NOTA: El gen nrdB (ribonucleotide reductase β- subunidad) es específico de CLas21. Se puede obtener fácilmente el amplicón nrdB del ADNg cítrico positivo para CLas utilizando el conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR. El conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR amplifica un fragmento nrdB de 1.060 pb, mientras que el conjunto de cebadores F-RPA-RNR y R-RPA-RNR amplifica un fragmento de 104 pb del gen nrdB, que es la parte del fragmento nrdB de 1.060 pb.</li>
	<li>Purificar los productos de PCR con un kit de extracción de gel de ADN siguiendo el manual del fabricante.</li>
	<li>Diluir los productos de PCR que contienen los amplicones nrdB conddH2Oesterilizado.</li>
	<li>Calcule el número de copias del gen nrdB utilizando el número de copia de ADN en línea disponible comercialmente y la calculadora de dilución.</li>
	<li>Preparar diluciones de ADN que contengan 2,01 × 106 copias/μL, 2,01 × 105 copias/μL, 2,01 × 104 copias/μL, 2,01 × 103 copias/μL, 2,01 × 10 2 copias/μL, 2,01 × 101 copias/μL, 2,01 × 100 copias/μL y2,01 × 10−1 copias/μL de fragmento de ADN CLas.</li>
</ol>4. Detección de muestras
NOTA: Después de la prueba de especificidad y sensibilidad, se utilizó el método CLas-DETECTR para detectar la presencia de CLas en las muestras de hojas de campo recolectadas de naranjos dulces Newhall cultivados en el vivero de recursos de germoplasma en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. Se realizó una qPCR para verificar los resultados.
<ol><li>Prueba un total de 15 árboles. Use el agua como un control negativo.</li>
	<li>Realice los métodos CLas-DETECTR y qPCR como se describió anteriormente. NOTA: Debido a las características de distribución desigual de CLas en cítricos, las hojas que mostraban síntomas de HLB se recolectaron como prioridad. Si un árbol parecía saludable, las hojas se recogían aleatoriamenteEl sistema CLas-DETECTR funciona correctamente.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Este estudio presenta un método rápido y portátil para detectar CLas denominado CLas-DETECTR, que combina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a. El flujo de trabajo se ilustra en la figura 1. CLas-DETECTR detecta CLas con especificidad y sensibilidad (Figura 2 y Figura 3). Además, utilizando muestras de hojas de Newhall, CLas-DETECTR detecta CLas con la misma sensibilidad que la qPCR (Figura 4</stron...

Huanglongbing (HLB) es una de las enfermedades de los cítricos más problemáticas en todo el mundo1. El HLB es causado por la bacteria colonizadora de floemas y fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluyendo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus y Ca. L. americanus2 . La especie asociada al HLB más prevalente en China y los EE.UU. es CLas, que se transmite por psílidos asiáticos de los cítricos (Diaphorina citri) o a través de injertos3. Después de ser infectados por CLas, los árboles de cítricos muestran una disminución del crecimiento hasta la muerte2. Los síntomas comunes de las hojas de cítricos infectadas con CLas son moteado con manchas, islas verdes (pequeños puntos circulares de color verde oscuro), venas corchosas elevadas en hojas más gruesas y coriáceas, y brotes amarillentos no uniformes2. Además, las frutas infectadas con CLas aparecen pequeñas y desequilibradas2.
Dado que ninguna variedad de cítricos es resistente al HLB y no existe cura terapéutica para el HLB, la prevención del HLB requiere la cuarentena y el aislamiento de los cítricos CLas-positivos 2,3. Por lo tanto, la detección temprana es crítica para el monitoreo y la cuarentena para prevenir la propagación de CLas y minimizar las pérdidas económicas3. Además, se necesita la detección sensible de CLas debido al bajo título de CLas en las plantas durante la etapa temprana de la infección3. En China, la detección de CLas generalmente es realizada por ciertos centros de prueba certificados. Sin embargo, el proceso de detección generalmente toma al menos 1 semana, y la tarifa de detección es costosa. Por lo tanto, para ayudar a monitorear la incidencia de HLB
Se han aplicado diversas tecnologías para diagnosticar HLB 4,5,6,7,8,9. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR) son las herramientas más utilizadas para la detección de CLas debido a su alta sensibilidad y especificidad 4,5. Sin embargo, esas tecnologías dependen en gran medida de instrumentos costosos y personal altamente calificado. Además, varios métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), han sido desarrollados como alternativas atractivas a los métodos convencionales de PCR debido a su simplicidad, rapidez y bajo costo 8,9,10. Sin embargo, es difícil aplicarlos para detectar con precisión CLas debido a las señales de amplificación no específicas, que pueden causar resultados falsos positivos.
La detección de ácidos nucleicos basada en endonucleasa basada en CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas regularmente / asociadas a CRISPR) se ha desarrollado como una tecnología de diagnóstico molecular de próxima generación debido a su alta sensibilidad, especificidad y confiabilidad11,12,13,14. Estas tecnologías de diagnóstico CRISPR/Cas se basan en la actividad nucleasa colateral de las proteínas Cas para escindir ADN monocatenario (ssDNA) modificado con un reportero fluorescente y un extintor de fluorescencia en cada extremo de los oligonucleótidos, así como un dispositivo de detección de fluorescencia para capturar el reportero fluorescente liberado11,12 . La actividad nucleasa de varios efectores Cas activados por el dúplex diana de ARN CRISPR (crRNA) puede escindir indiscriminadamente el ssDNA11 circundante no diana. CRISPR-Cas12a (también llamado Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas de clase 2 tipo V-A, demuestra varias ventajas en comparación con Cas9, como una menor tolerancia al desajuste y una mayor especificidad13. El sistema Cas12a/crRNA ha sido aplicado para la detección sensible y específica de los ácidos nucleicos de patógenos humanos y fitopatógenos 14,15,16,17,18. Por lo tanto, la utilización del sistema Cas12a / crRNA debería permitir la detección precisa y sensible del ácido nucleico de CLas.
Cas12a solo no es teóricamente lo suficientemente sensible como para detectar niveles bajos de ácidos nucleicos. Por lo tanto, para mejorar su sensibilidad de detección, la detección de CRISPR-Cas12a se combina típicamente con un paso de amplificación isotérmica14,15. La amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) permite la amplificación isotérmica sensible y rápida del ADN en un rango de temperatura de 37 °C a 42 °C19.
Una plataforma de detección llamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina la actividad DNasa de Cas12a con RPA y una lectura de fluorescencia ha sido ideada recientemente12 y se ha demostrado que detecta ácido nucleico con mayor sensibilidad20. Además, la señal de fluorescencia emitida por las muestras positivas se puede observar a través de un dispositivo portátil de detección de fluorescencia en el campo.
Dado que amplificamos el ADN con RPA, diseñamos crRNA dirigido al gen nrdB (ribonucleonucleotide reductase β- subunidad) de cinco copias específico para CLas21, y empleamos la actividad DNasa de la proteína Cas12a, llamamos a este método de detección CLas CLas-DETECTR. En comparación con los métodos de detección de CLas existentes, CLas-DETECTR es rápido, preciso, sensible e implementable.

<table><tbody><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN AxyPrep</td><td>Corning</td><td>09319KE1</td><td>China</td></tr><tr><td>Kit de extracción de ADN genómico bacteriano</td><td>Solarbio</td><td>D1600</td><td>China</td></tr><tr><td>EnGen LbCas12a&nbsp;</td><td>TOLOBIO</td><td>32104-01</td><td>China</td></tr><tr><td>Ex Taq Versión 2.0 más tinte</td><td>TaKaRa</td><td>RR902A</td><td>China</td></tr><tr><td>Dispositivo de detección fluorescente de mano&nbsp;</td><td>LUYOR</td><td>3415RG</td><td></td></tr><tr><td>China Perforadora &nbsp;</td><td>Deli</td><td>114</td><td>China</td></tr><tr><td>Acetato de magnesio, MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>Reino Unido</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SCR</td><td>10019718</td><td>China</td></tr><tr><td>NEB buffer 3.1&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7203</td><td>EE. UU</td></tr>. <tr><td>Tubos de tira de PCR</td><td>LABSELECT</td><td>PST-0208-FT-C</td><td>China</td></tr><tr><td>PEG 200&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3015</td><td>USA</td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td><td>TaKaRa</td><td>R045A</td><td>China</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>N0550S</td><td>EE. UU.</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td><td>TaKaRa</td><td>RR820B</td><td>China</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>Reino Unido</td></tr></tbody></table>

detección de candidatus liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con crispr-cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

La detección temprana de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por los productores de cítricos facilita la intervención temprana y previene la propagación de la enfermedad. Aquí se presenta un método simple para el diagnóstico rápido y portátil de Huanglongbing (HLB) que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa y un reportero fluorescente que utiliza la actividad nucleasa del sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas / 12a asociado a CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilidad de esta técnica es mucho mayor que la PCR. Además, este método mostró resultados similares a la qPCR cuando se utilizaron muestras de hojas. En comparación con los métodos de detección de CLas convencionales, el método de detección presentado aquí se puede completar en 90 minutos y funciona en una condición isotérmica que no requiere el uso de máquinas de PCR. Además, los resultados se pueden visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo.

Aquí, hemos descrito una plataforma portátil, CLas-DETECTR, que peina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a para diagnosticar HLB en el campo. El esquema de CLas-DETECTR se ilustra en la figura 1A.
Cuando las muestras de hojas de los árboles Newhall infectados con HLB y no infectados con HLB (Figura 1B), para los cuales la presencia de CLas se confirmó mediante PCR (Figura 1C), se sometieron a la prueba CLas-DETECTR, se observó una señal de fluorescencia verde en la mu...

En este trabajo, se desarrolló un método de detección rápido, sensible y portátil para Candidatus Liberibacter asiaticus basado en la amplificación de la polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a.

Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abreviado como HLB. Es una enfermedad devastadora de los cítricos en todo el mundo. En los países más productores de cítricos, como China y los Estados Unidos, el HLB es causado por la bacteria restringida en floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abreviada como CLas.La detección temprana de CLas fue importante para los productores, facilitando la intervención temprana y previniendo la propagación de la enfermedad. Así que aquí desarrollamos un nuevo método para el diagnóstico rápido y portátil de HLB, combinado con la amplificación de polimerasa recombinasa y el sistema CRISPR-Cas12a. Lo llamamos CLas-DETECTR.La sensibilidad de nuestra plataforma es mucho mayor que la PCR. Además, muestra un resultado similar con qPCR cuando se utilizaron las muestras de hojas. Compare con las detecciones convencionales de CLas, nuestro método se puede terminar en 90 minutos y funciona en condiciones isotérmicas.El resultado también se puede visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo. El CLas-DETECTR contiene cuatro pasos: preparación de la solución, aislamiento de ADN total cítrico, amplificación isotérmica del ADN y los resultados de la visualización. El esquema del ensayo CLas-DETECTR se ilustra aquí.El tampón A, la solución B y la solución C se preparan como se describe en el protocolo. Para ahorrar tiempo y hacer que este método sea adecuado para la detección de CLas de campo, se utilizó el enfoque basado en polietilenglicol E. coli para obtener extractos de plantas crudas para la amplificación de ADN. Las hojas de cítricos se utilizan en la herramienta.Perfora los pocos trozos de discos de hojas de hoja. Coloque los discos de hojas en un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros. Luego, agregue 200 microlitros de tampón A en el tubo.Moler los discos de hojas hasta que queden suaves con una varilla de plástico manualmente. Deje el tubo sin interrupciones durante 10 minutos. El sobrenadante se aplica posteriormente a la amplificación del ADN.Para la amplificación isotérmica del ADN, agregue un microlitro de sobrenadante del paso 2.3 y un microlitro de acetato de magnesio en la solución B y mezcle bien. En el laboratorio, incubarlos en una incubadora simple a 37 grados durante 15 minutos. Para visualizar los resultados, agregue 10 microlitros de la mezcla del paso 3.2 en la solución C y mezcle bien.Incubarlos en la incubadora de 37 grados durante 60 minutos. Use una gafa y observe la señal de fluorescencia verde a través de un dispositivo de detección fluorescente de mano. Para probar la especificidad de CLas-DETECTR, primeras colonias puras de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri, que es el patógeno del cancro de los cítricos, y Burkholderia stabilis cepa 1440 aislada en nuestro laboratorio, se utilizaron para extraer su ADN genómico. Luego, este ADN genómico de tres bacterias y el ADN genómico de hojas de Newhall positivo para CLas se sometieron a la prueba CLas-DETECTR. Para probar la sensibilidad de CLas-DETECTR, se detectaron una serie de diluciones de fragmentos de ADN de CLas utilizando PCR, CLas-DETECTR y qPCR como se describe en el protocolo. Después de la especificidad y la prueba de sensibilidad, se utilizó el método CLas-DETECTR para detectar la presencia de CLas en campo.Muestras de hojas recolectadas del naranjo dulce Newhall cultivado en el vivero de recursos de germoplasma en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. También se aplicó qPCR, un método convincente de detección de CLas generalmente utilizado en el laboratorio. Las muestras de hojas del árbol de Newhall infectado con HLB y no infectado con HLB, en el que se confirmó la presencia del CLas en nuestro laboratorio, se sometieron a la prueba CLas-DETECTR.La señal de fluorescencia verde se capturó en la muestra infectada con HLB, pero no en el control negativo y no infectado con HLB. Se determinó la especificidad de CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de otras bacterias. En el ensayo CLas-DETECTR, solo el ADNg extraído de hojas de Newhall positivas para CLas demostró señales fluorescentes verdes.El ADNg extraído de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri y Burkholderia stabilis cepa 1440 no lo hicieron, lo que significa que el CLas-DETECTR puede detectar CLas específicamente. También probamos la sensibilidad de CLas-DETECTR utilizando una serie de diluciones de ADN CLas, enumeradas en el protocolo.La PCR puede detectar 201 copias por megalitro. Por otro lado, CLas-DETECTR puede detectar 2,01 copias por megalitro, lo que sugiere su disponibilidad como un diagnóstico de campo sensible. qPCR puede detectar 0,201 copias por megalitro y el valor de Ct es superior a 36.Por lo tanto, CLas-DETECTR es dos órdenes de magnitud más sensible que la PCR tradicional y un orden de magnitud menos sensible que la qPCR cuando se utilizaron amplicones específicos de CLas diluidos. Finalmente, se reexaminó la viabilidad del CLas-DETECTR para muestras de campo, y se comparó su sensibilidad con la qPCR. En cifras, vemos.Podemos ver que el valor de Ct es superior a 36 cuando la concentración de CLas es inferior a 0,2 copias por megalitro, que es una concentración muy baja. Entre las 15 muestras, el valor de Ct de las muestras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 y 14 detectadas por qPCR fue inferior a 36. Se observó una aparente señal de fluorescencia verde.Por otro lado, cuando el valor de Ct de las muestras 6, 7, 9, 12 y 15 detectadas por qPCR fue indeterminado, no se observaron señales fluorescentes verdes. Además, se observaron señales fluorescentes verdes débiles cuando el valor de TC de las muestras 5 y 11 detectadas por qPCR fue superior a 36. Los resultados sugerirán que nuestra plataforma es una herramienta rápida, robusta y sensible para el diagnóstico de HLB en el campo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Los sistemas CRISPR-Cas y las proteínas anti-CRISPR se integraron en el esquema de puertas booleanas en Saccharomyces cerevisiae. Los nuevos circuitos lógicos pequeños mostraron un buen rendimiento y profundizaron la comprensión de los factores de transcripción basados en dCas9 / dCas12a y las propiedades de las proteínas anti-CRISPR.

Circuitos digitales genéticos basados en sistemas CRISPR-Cas y proteínas anti-CRISPR

Presentamos un protocolo que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa con un sistema CRISPR/Cas12a para la detección de trazas de virus de ADN y construye una microscopía portátil para teléfonos inteligentes con una clasificación asistida por inteligencia artificial para la detección de virus de ADN en el punto de atención.

Sistema de detección de virus de ADN basado en RPA-CRISPR/Cas12A-SPM y Deep Learning

Aquí, presentamos la preparación paso a paso de la amplificación isotérmica premezclada basada en recombinasa liofilizada y reacciones basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), que se pueden utilizar para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos de patógenos de enfermedades infecciosas u otros marcadores genéticos de interés.

Diagnóstico basado en CRISPR en el punto de atención con reactivos premezclados y liofilizados

Para facilitar la detección rápida y precisa de Acinetobacter baumannii, presentamos un protocolo que emplea la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) junto con la endonucleasa LbaCas12a para identificar infecciones por A. baumannii .

Detección rápida y específica de infecciones por Acinetobacter baumannii mediante un sistema de amplificación de polimerasa recombinasa/Cas12A

En este protocolo, se ilustra un ensayo combinado de amplificación de polimerasa recombinasa CRISPR / Cas12a para la detección del patógeno vegetal invasor , Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza tropical 4.

Ensayo combinado de amplificación de polimerasa recombinasa CRISPR/Cas12a para detectar Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza tropical 4

Aquí, describimos un procedimiento simple y rápido para detectar ADN de patógenos de abejas, como Lotmaria passim y Nosema ceranae, utilizando una lisis celular lista para la amplificación, amplificación de polimerasa recombinasa y ensayos CRISPR/Cas12a.

Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

El advenimiento de la recombinasa específica de sitio (SSR) la tecnología y el sistema Cre / lox ha dado lugar a numerosos avances en biología molecular, y ha demostrado ser una valiosa herramienta para la evaluación de la función génica en animales transgénicos. Esta entrevista analiza el mecanismo de recombinación sitio específico por ciclación recombinasa (CRE) y cómo el uso de esta enzima ha llevado al desarrollo de mutagénesis condicional, la cual tiene ventajas significativas sobre las...

Principios de la recombinasa específica de sitio (RSS) Tecnología

Aquí se presenta la generación de Tre recombinasa a través de las instrucciones, la evolución molecular. Tre recombinasa reconoce una secuencia de destino predefinido dentro de las secuencias LTR del provirus VIH-1, dando lugar a la escisión y la erradicación de la provirus de las células humanas infectadas. Aunque todavía en sus inicios, la evolución molecular dirigida a permitir la creación de enzimas personalizados que servirán de instrumentos de cirugía molecular y la medicina molecular.

Evolución molecular de la recombinasa Tre

Actual del VIH-1 estrategias de actuar para suprimir el ciclo de vida del virus, pero no efectiva erradicación de la infección. Aquí, se demuestra que una recombinasa diseñado de manera eficiente los impuestos especiales integrados de VIH-1 proviral del ADN del genoma de las células infectadas.

Entrevista: El VIH-1 La escisión del ADN proviral uso de una recombinasa evolucionado

Aprende a detectar Candidatus Liberibacter asiaticus en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa con CRISPR-Cas12a. Este método portátil ofrece alta sensibilidad para diagnosticar Huanglongbing en cítricos en solo 90 minutos.

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