Name: Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprende a seleccionar aptámeros de ADN que distinguen virus infecciosos de no infecciosos mediante SELEX. Esta técnica permite desarrollar sensores para diagnóstico clínico y monitoreo ambiental sin conocimiento previo de la estructura viral.

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Laura M. Cooper y al Dr. Lijun Rong de la Universidad de Illinois en Chicago por proporcionar las muestras de pseudovirus utilizadas en este protocolo (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), así como al Dr. Álvaro Hernández y al Dr. Chris Wright de la instalación de Servicios de ADN del Centro de Biotecnología Roy J. Carver de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign por su asistencia con la secuenciación de alto rendimiento, y muchos miembros del grupo Lu que nos han ayudado con la selección in vitro y las técnicas de caracterización de aptámeros. Este trabajo fue apoyado por una subvención RAPID de la National Science Foundation (CBET 20-29215) y una subvención inicial del Instituto de Sostenibilidad, Energía y Medio Ambiente de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign e Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. agradece a la PEW Latin American Fellowship por su apoyo financiero. También agradecemos a la Fundación Robert A. Welch (Subvención F-0020) por el apoyo al programa de investigación del grupo Lu en la Universidad de Texas en Austin.

Los autores no tienen nada que revelar.

SELEX permite no sólo la identificación de aptámeros con alta afinidad, en el rango pM-nM 22,43,44,45, sino también con alta y sintonizable selectividad. Al aprovechar la contraselección, se pueden obtener aptámeros con selectividad desafiante. Por ejemplo, el grupo Li ha demostrado la capacidad de obtener secuencias que pueden diferenciar cepas bacterianas patógenas de cepas no patógenas<sup ...

Las infecciones por virus tienen enormes impactos económicos y sociales en todo el mundo, como se hizo cada vez más evidente a partir de la reciente pandemia de COVID-19. El diagnóstico oportuno y preciso es primordial en el tratamiento de infecciones virales y al mismo tiempo previene la propagación de virus a personas sanas. Si bien se han desarrollado muchos métodos de detección de virus, como las pruebas de PCR1,2 y los inmunoensayos3, la mayoría de los métodos utilizados actualmente no son capaces de determinar si el virus detectado es realmente infeccioso o no. Esto se debe a que la presencia de componentes del virus solos, como el ácido nucleico viral o las proteínas, no indica que el virus infeccioso intacto esté presente, y los niveles de estos biomarcadores han mostrado una correlación deficiente con la infectividad 4,5,6. Por ejemplo, el ARN viral, comúnmente utilizado para las pruebas actuales de COVID-19 basadas en PCR, tiene niveles muy bajos en las primeras etapas de la infección cuando el paciente es contagioso, mientras que el nivel de ARN a menudo sigue siendo muy alto cuando los pacientes se han recuperado de la infección y ya no son contagiosos 7,8. Los biomarcadores de proteínas o antígenos virales siguen una tendencia similar, pero típicamente aparecen incluso más tarde que el ARN viral y, por lo tanto, son aún menos predictivos de infectabilidad 6,9. Para abordar esta limitación, se han desarrollado algunos métodos que pueden informar sobre el estado de infectividad del virus, pero se basan en técnicas de microbiología de cultivos celulares que requieren mucho tiempo (días o semanas) para obtener resultados 4,10. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos sensores que puedan informar sobre la infectabilidad de las muestras clínicas o ambientales puede evitar retrasos en el tratamiento y una mayor propagación del virus. Sin embargo, muy pocos métodos pueden obtener moléculas de detección que puedan reconocer un virión infeccioso intacto y diferenciarlo del mismo virus que se ha vuelto no infeccioso.
En este contexto, los aptámeros son particularmente adecuados como una herramienta biomolecular única11,12,13,14. Los aptámeros son moléculas cortas de ADN o ARN monocatenario con una secuencia específica de nucleótidos que les permite formar una conformación 3D específica para reconocer un objetivo con alta afinidad y selectividad15,16. Se obtienen mediante un proceso de selección combinatoria denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX), también conocido como selección in vitro, que se lleva a cabo en tubos de ensayo con una gran biblioteca de muestreo aleatorio de ADN de 10 14-10 15 secuencias17,18,19. En cada ronda de este proceso iterativo, el conjunto de ADN se somete primero a una presión de selección a través de la incubación con el objetivo en las condiciones deseadas. Cualquier secuencia que no esté unida al objetivo se elimina, dejando atrás solo aquellas pocas secuencias que pueden unirse en las condiciones dadas. Finalmente, las secuencias que se han seleccionado en el paso anterior se amplifican mediante PCR, enriqueciendo la población del pool con las secuencias funcionales deseadas para la siguiente ronda de selección, y se repite el proceso. Cuando la actividad del grupo de selección alcanza una meseta (generalmente después de 8-15 rondas), la biblioteca se analiza mediante secuenciación de ADN para identificar las secuencias ganadoras que exhiben la mayor afinidad.
SELEX tiene ventajas únicas que pueden ser explotadas para obtener una mayor selectividad contra otros objetivos similares20,21, como el estado de infectividad del virus 22. En primer lugar, se puede utilizar una amplia variedad de diferentes tipos de dianas para la selección, desde pequeñas moléculas y proteínas hasta patógenos y células enteras16. Por lo tanto, para obtener un aptámero que se une a un virus infeccioso, se puede usar un virus intacto como objetivo, en lugar de una proteína de superficie viral19. Virus completo SELEX permite la selección de aptámeros que se unen específicamente al estado nativo del virus, sin necesidad de interrumpir el virus. En segundo lugar, SELEX puede fabricarse a medida para eliminar objetivos competidores 21,23, como otros virus similares o virus inactivos no infecciosos, utilizando pasos de contraselección en cada ronda de selección22. Durante los pasos de contraselección, el grupo de ADN se expone a objetivos para los que no se desea la unión, y cualquier secuencia que se una se descarta.
En este trabajo, proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen a un virus infeccioso pero no al mismo virus que se ha vuelto no infeccioso por un método de desinfección particular o a otros virus relacionados. Este método permite obtener agentes de reconocimiento en función de las diferencias funcionales de la superficie del virus, que no necesitan ser conocidas de antemano, por lo que ofrece una ventaja adicional para la detección de patógenos recién emergidos o para enfermedades poco estudiadas.

<table><tbody><tr><td>Persulfato de amonio al 10% (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS sin calcio y magnesio</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>40% solución de acrilamida/bisacrilamida (29:1)</td><td>BioRad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA perlas de limpieza - Sección 7.2.2</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5</td><td>Merck</td><td>UFC501024</td><td>corte 10 kDa</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5</td><td>Merck</td><td>UFC510024</td><td>corte 100 kDa</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch termociclador con doble módulo de reacción rápida 48/48</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>BioRad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Baños secos digitales/calentadores de bloque</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td>perlas magnéticas modificadas con estreptavidina - Sección 4.9</td></tr><tr><td>Sal disódica EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>324503</tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Eppendorf Safe-Lock</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>632200</td><td>Kit de cuantificación de lentivirus - Sección 3.3.2.1</td></tr><tr><td>Gradilla de separación MagJET, tubo de 12 x 1,5 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>MR02</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Placa de sellado PCR Película, adhesiva, óptica</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td> Tetra Cell Mini-PROTEAN que <td>no absorbe los rayos UV</td></tr><tr><td>para geles prefabricados de gel listo</td><td>BioRad</td><td>1658004EDU</td><td></td></tr><tr><td>Placas cortas Mini-PROTEAN</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Placas espaciadoras Mini-PROTEAN con espaciadores integrados de 0,75 mm</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td></td></tr><tr><td>Grado de Biología Molecular</td><td>Lonza</td><td>51200</td><td></td></tr><tr><td>Multiplaca Placas de PCR de 96 pocillos, de perfil alto, sin faldón, transparentes</td><td>BioRad</td><td>MLP9611</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq DNA Polymerase</td><td>New England BioLab</td><td>M0480S</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td><td>Tecan</td><td>0344NB-A01 Kit de preparación de</td><td>bibliotecas de secuenciación de alto alcance - Sección 7.2.</td></tr><tr><td>PIPETMAN G (100-1000 y micro; L, 20-200 y micro; L, 2-20 y micro; L y 0,2-2 y micro; L)</td><td>Gilson</td><td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Purificador Logic+ Clase II, Tipo A2 Cabinas de bioseguridad</td><td>Labconco</td><td>4261</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>basado en fluorescencia&nbsp; dsDNA cuantificación&nbsp; - Sección 7.2.3 Puntas de</td></tr><tr><td>pipeta de baja retención SHARP Classic (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002440</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725201</td><td>qPCR mastermix - Sección 6.2.</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tubos y Tapas Ultra Transparentes, tiras de 8</td><td>tubos de PCR</td><td>científicos de EE. UU</td>. <td>AB1183</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Las infecciones por virus tienen un gran impacto en la sociedad; La mayoría de los métodos de detección tienen dificultades para determinar si un virus detectado es infeccioso, lo que provoca retrasos en el tratamiento y una mayor propagación del virus. El desarrollo de nuevos sensores que puedan informar sobre la infectabilidad de muestras clínicas o ambientales enfrentará este desafío no cumplido. Sin embargo, muy pocos métodos pueden obtener moléculas de detección que puedan reconocer un virus infeccioso intacto y diferenciarlo del mismo virus que se ha vuelto no inactivo por métodos de desinfección. Aquí, describimos un protocolo para seleccionar aptámeros que puedan distinguir virus infecciosos de virus no infecciosos utilizando la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). Aprovechamos dos características de SELEX. En primer lugar, SELEX se puede hacer a medida para eliminar objetivos competidores, como virus no infecciosos u otros virus similares, utilizando la selección de contadores. Además, todo el virus se puede utilizar como objetivo de SELEX, en lugar de, por ejemplo, una proteína de superficie viral. Virus completo SELEX permite la selección de aptámeros que se unen específicamente al estado nativo del virus, sin la necesidad de interrumpir el virus. Por lo tanto, este método permite obtener agentes de reconocimiento basados en diferencias funcionales en la superficie de los patógenos, que no necesitan ser conocidas de antemano.

Dado que los aptámeros de ADN se pueden obtener utilizando SELEX en un tubo de ensayo15, esta estrategia de SELEX fue cuidadosamente diseñada para incluir pasos de selección positiva hacia el virus infeccioso intacto y completo (es decir, retener las moléculas de ADN que se unen al virus infeccioso), así como pasos de contraselección para el mismo virus que se ha vuelto no infeccioso por un método de desinfección particular. específicamente el tratamiento UV, descartando las secuencias de ADN que...

Proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen solo a virus infecciosos y no a virus que se han vuelto no infecciosos mediante un método de desinfección o a cualquier otro virus similar. Esto abre la posibilidad de determinar el estado de infectividad en pruebas portátiles y rápidas.

Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Este protocolo describe cómo seleccionar aptámeros de ADN que puedan distinguir virus infecciosos de virus no infecciosos para obtener moléculas de detección capaces de informar la infectabilidad de muestras clínicas o ambientales. Esta técnica se puede aplicar para obtener aptámeros selectivos para muchos otros virus, incluidos los virus emergentes, ya que no requiere un conocimiento previo de las estructuras o secuencias del virus. Esta técnica permite el desarrollo de sensores aptámeros para el diagnóstico clínico y el monitoreo ambiental de virus infecciosos para detectar si alguien es contagioso o si un método de desinfección ambiental funciona según lo previsto.La selección puede ser un proceso difícil, especialmente para aquellos que son nuevos en ella. Es importante optimizar las condiciones de PCR y monitorear el progreso de la selección con qPCR. Demostrando el procedimiento estará Marcos Gramajo, un estudiante graduado de mi laboratorio.Para comenzar, diseñe la biblioteca y los cebadores iniciales de monocatenario o SS-ADN. Obtenga los oligos de ADN de fuentes comerciales con purificación de desalinización estándar. Purificar la biblioteca de SS-DNA y los cebadores en electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% seguida de precipitación de etanol.A continuación, obtenga una solución madre de virus infecciosos y no infecciosos o prepárelos como se describe en el texto manuscrito. Para la desnaturalización de la biblioteca de SS-ADN, mezcle 10 microlitros de la biblioteca de ADN-SS de 100 micromolares con 240 microlitros de tampón SELEX. Caliente la mezcla a 95 grados centígrados durante 15 minutos en un baño seco, luego coloque el tubo en hielo durante 15 minutos.Mezcle 250 microlitros de la biblioteca SS-DNA en el tampón SELEX con 50 microlitros de virus infecciosos para una selección positiva. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente. Luego agregue 400 microlitros de una secuencia T20 milimolar a un filtro de 0.5 mililitros para bloquear los sitios no específicos.Incubar los filtros durante 30 minutos. Centrifugar el filtro a 14, 000 G durante 10 minutos para eliminar la solución T20. A continuación, lave el filtro tres veces con el tampón SELEX para eliminar el exceso de secuencias T20.A continuación, agregue la mezcla de virus infecciosos de la biblioteca SS-DNA al filtro bloqueado de 100 kilodalton y al centrífugo para lavar las secuencias no unidas. Lave el filtro tres veces añadiendo 400 microlitros de tampón SELEX y centrifugación. Mantenga la fracción en el filtro y deseche el flujo.Para eluyir secuencias unidas, cambie el tubo de recolección del filtro centrífugo y agregue 300 microlitros de tampón SELEX que contiene ocho molares de urea al filtro. Caliente el filtro a 95 grados centígrados durante 15 minutos, luego centrifugar para recoger el flujo que contiene las secuencias eluyidas. Una vez hecho esto, lava los materiales con lejía al 10%.A continuación, agregue la solución de virus infeccioso SS-DNA recolectada en el paso anterior a un filtro bloqueado de 10 kilodalton, centrifugar a 14, 000 G durante 15 minutos y desechar el flujo. Lave el filtro tres veces con 300 microlitros de tampón SELEX para eliminar la urea por centrifugación y deseche el flujo continuo. Recupere la solución en el filtro dándole la vuelta en un tubo de recolección limpio y centrifugando durante cinco minutos.Mida el volumen final de la solución recuperada con una pipeta y etiquétela como una muestra de la Ronda 1A. Tome el 90% de la muestra de la Ronda 1A como plantilla en la primera ronda y ejecute la PCR utilizando condiciones optimizadas. Para recuperar SS-DNA utilizando perlas magnéticas modificadas con estreptavidina o MB, divida el producto en alícuotas de 50 microlitros y agréguelas a tubos de microcentrífuga que contengan 50 microlitros MB. Incubar el tubo durante 30 minutos con agitación leve a temperatura ambiente.Luego coloque el tubo en la rejilla magnética para aislar el MB y retire el sobrenadante mediante pipeteo. Lave el MB dos veces agregando 200 microlitros de tampón de unión y lavado al tubo. A continuación, retire el tubo de la rejilla magnética y golpee antes de volver a suspender el MB a una solución homogénea mediante pipeteo.Coloque el tubo de nuevo en la rejilla magnética y retire el sobrenadante. Después del segundo lavado, resuspender el MB en 100 microlitros de tampón SELEX y calentar la solución a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Coloque inmediatamente el tubo en la rejilla magnética y recoja el sobrenadante que contiene la piscina de ADN-SS.Repita este paso de recuperación añadiendo 50 microlitros de tampón SELEX. Mida el volumen final de la fracción recuperada y etiquétela como Ronda 1X. Para la desnaturalización de la reserva de ADN-SS, tome el 60% de la muestra Round 1X y mézclela con 50 microlitros de tampón SELEX.Caliente la muestra en un baño seco, luego coloque el tubo en hielo durante 15 minutos. A continuación, mezcle la piscina de SS-DNA desnaturalizada en el tampón SELEX con 50 microlitros de cada virus como paso de contraselección e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de bloquear los sitios no específicos en los filtros de centrífuga, agregue la mezcla desnaturalizada SS-DNA pool incubada con una solución de virus a un filtro bloqueado de 100 kilodalton.Centrifugar el filtro a 14, 000 G durante 10 minutos y recoger el flujo a través. Tome 300 microlitros de fracción y mezcle con 50 microlitros de virus infecciosos que contengan 100 millones de copias por mililitro. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente.Prepare una mezcla maestra estándar de qPCR y diluciones de la biblioteca de ADN-SS purificada como se describe en el texto. Ejecute la qPCR para determinar el ciclo de umbral. Después de la carrera, use una curva estándar para cuantificar la cantidad de SS-DNA en la Ronda 1A y la Ronda 1X.Luego calcule el rendimiento de elución como la cantidad de ADN unida dividida por la cantidad inicial de ADN y trace el rendimiento de elución frente al número redondo. Finalmente, trace las curvas de fusión para diferentes rondas. Para una secuenciación de alto rendimiento, seleccione un kit apropiado disponible comercialmente.Prepare varios grupos de rondas de selección que representen un enriquecimiento alto, medio y bajo, así como el grupo final utilizando un par diferente de índices en los adaptadores para cada grupo. A continuación, envíe la biblioteca final preparada a la instalación de secuenciación. Para el análisis de secuenciación, las secuencias han sido desmultiplexadas por la instalación de secuenciación.Elimine los adaptadores de secuenciación y los cebadores de selección mediante el programa de línea de comandos Cutadapt. A continuación, utilice el programa FASTX-Toolkit para eliminar secuencias de baja calidad. A continuación, combine los archivos de secuencia en la dirección inversa con los de la dirección de avance utilizando la función de complemento de FASTX_reverse_ FASTX-Toolkit en los archivos de dirección inversa.Luego use el programa CAT incorporado para combinar los archivos en un solo archivo. Utilice el kit de herramientas de análisis FASTAptamer para analizar el enriquecimiento de secuencias en diferentes grupos de selección. En primer lugar, utilizar las funciones de recuento de FASTAptamer y clúster de FASTAptamer para agrupar secuencias similares en clústeres.A continuación, utilice la función de enriquecimiento FASTAptamer para obtener información sobre el enriquecimiento de secuencias y grupos. Identificar las secuencias de aptámeros candidatos a partir de la información de enriquecimiento obtenida a través del análisis de secuencias. Seleccione varias secuencias de aptámeros y realice el cribado inicial mediante un ensayo de enlace.En este análisis, se utilizó qPCR para monitorear el progreso de SELEX de aptámeros infecciosos específicos del SARS-CoV-2. El rendimiento de elución aumentó inicialmente con cada ronda de SELEX y se niveló en las rondas ocho y nueve. Al comparar las curvas de fusión, se observó un cambio desde el pico a una alta temperatura de fusión de 77 a 79 grados centígrados.Además, en las dos últimas rondas, se observó un pico a una baja temperatura de fusión. Se muestra la abundancia relativa en lecturas por millón para el SARS2 AR10 secuenciado obtenido en rondas de selección consecutivas. La estructura predicha del SARS2 AR10 mostró una estructura secundaria estructurada que contiene una región del bucle del tallo que podría estar involucrada en el reconocimiento del virus.Una vez que se obtienen los aptámeros, se pueden incorporar a ópticas eléctricas, otro tipo de sensores, para desarrollar una prueba de detección rápida y portal de virus que pueda informar la infectividad del virus. Prevemos que se puede obtener aptámero específico para diferentes variantes o estereotipos de virus, lo que hace posible el monitoreo rápido de las variantes que son la mayor amenaza para la sociedad.

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SELEX protocolos comprenden múltiples rondas de selección, cada uno de los cuales requieren la regeneración de ligandos unidos, que a su vez requieren secuencias fijas de imprimación que flanquean las regiones de la biblioteca al azar. Estas secuencias de los cebadores fija puede interferir con el proceso de selección (falsos positivos y negativos). Aquí presentamos una cartilla sin protocolo.

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