Name: Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a disociar tejido pancreático para aislar células individuales viables de tumores y lesiones pre-malignantes. Este protocolo facilita la investigación de biomarcadores y tratamientos para enfermedades pancreáticas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a la Dra. Avital Sarusi-Portuguez por su ayuda en el análisis de datos y al Dr. Dror Kolodkin-Gal por su ayuda en el establecimiento del protocolo en un estudio anterior. Agradecemos a todos los miembros pasados y presentes del laboratorio Parnas. Agradecemos a la Dra. Gillian Kay y al Dr. Michael Kanovsky por su ayuda en la edición. Este proyecto ha recibido financiación de la beca de la Fundación de Ciencias de Israel (No. 526/18 O.P.), el Programa Alex U. Soyka y una subvención del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel (Premio al Desarrollo de la Carrera de Investigación).

El comité conjunto de ética (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) de la Universidad Hebrea (Jerusalén, Israel) y el Centro Médico Hadassah (Jerusalén, Israel) aprobó el protocolo del estudio para el bienestar animal (MD-18-15417-5 "Dinámica tisular en el cáncer de páncreas en ratones"), y el protocolo presentado aquí cumplió con todas las regulaciones éticas relevantes para la experimentación e investigación con animales. La Universidad Hebrea es un instituto acreditado por la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.
NOTA: La cepa de ratón #007908, la cepa #019378 y la cepa #008179 se obtuvieron del laboratorio de Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) se crearon cruzando las cepas anteriores. Para el estudio se utilizaron ratones de ambos sexos, entre 6 semanas y 15 meses de edad. El tamoxifeno se preparaba disolviendo el polvo en aceite de maíz. Ratones adultos (6-8 semanas de edad, hembras y machos) fueron inyectados con tamoxifeno por vía subcutánea en los días 0 y 2 a una dosis de 400 mg/kg y examinados dos veces por semana después de la inyección. No fue posible medir los tumores ya que estaban localizados internamente; Por lo tanto, se practicó la eutanasia si se observaban signos clínicos anormales según el protocolo ético. Los ratones fueron sacrificados en diferentes momentos después de la inducción con tamoxifeno, utilizando isoflurano y luxación cervical.
1. Disección pancreática
NOTA: Para obtener un rendimiento óptimo durante la extracción y para garantizar una buena viabilidad celular, es fundamental una disección rápida. Para acortar el tiempo requerido para el aislamiento del páncreas, todos los instrumentos y equipos deben estar listos en hielo antes de sacrificar al ratón.
<ol><li>Aplicar la eutanasia al ratón mediante asfixia con CO2 y verificar mediante luxación cervical. A partir de este paso, todos los procedimientos deben realizarse con instrumentos de disección estériles.</li>
	<li>Fije el ratón y rocíe el abdomen con etanol al 70%. Realice una incisión en forma de V de 2,5 cm en la zona genital con tijeras y fórceps y proceda hacia arriba para abrir completamente la cavidad abdominal.</li>
	<li>Localiza el estómago en el lado izquierdo del ratón. Localiza el páncreas, que está cerca del bazo. Separe el páncreas del estómago y el duodeno con dos pinzas (sin desgarrar). Continúe y separe el páncreas del intestino delgado, el yeyuno y el íleon.</li>
	<li>Mueva el páncreas hacia el lado derecho del ratón. Separe las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica con pinzas para separar completamente el páncreas y el bazo adherido.</li>
	<li>Retire el páncreas y extiéndalo para examinarlo en una placa de Petri con hielo. NOTA: Se debe tener cuidado durante este paso de extirpar solo el páncreas, y no eliminar el tejido graso mesentérico u otro tejido adyacente junto con el páncreas, para evitar la contaminación celular.</li>
</ol>2. Disociación enzimática y mecánica del páncreas
<ol><li>Prepare los siguientes búferes con anticipación.<ol><li>Tampón de disociación 1: 4 mL de tripsina C + 6 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (ver Tabla 1) para cada muestra.</li>
		<li>Tampón de disociación 2: 9 mL de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) 1x; albúmina sérica bovina (BSA) al 4%; 1 mL de colagenasa P (10 mg/mL); 200 μL de inhibidor de tripsina (10 mg/mL); y 200 μL de DNasa I (10 mg/mL) (ver Tabla 1).</li>
		<li>Tampón de lavado: 50 ml de HBSS 1x; 2 g de BSA; 1 mL de inhibidor de tripsina (10 mg/mL); y 1 mL de DNasa 1 (10 mg/mL).</li>
		<li>Solución de parada de actividad enzimática: HBSS 1x que contiene un 5% de suero fetal bovino (FBS) y 150 g de DNasa I (0,2 mg/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque el páncreas en un tubo de 50 ml sobre hielo. Enjuague el páncreas en FBS al 10% en HBSS 1x. El tejido graso flotará y el páncreas se hundirá. Esta es una manera fácil de visualizar y eliminar rápidamente el tejido adiposo blanco contaminante que aún está adherido al páncreas.</li>
	<li>Transfiera el tejido pancreático del ratón a una placa de Petri estéril que contenga 5 ml de HBSS 1x en hielo. Cortar el páncreas en trozos pequeños de 1 a 3mm3 con unas tijeras Noyes y un bisturí (Figura 2A). En caso de más de una muestra, las muestras deben mantenerse en hielo al 10% de FBS/HBSS 1x.</li>
	<li>Transfiera los tejidos a un tubo centrífugo. Centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min. Aspire y deseche el sobrenadante para eliminar los fragmentos celulares y las células sanguíneas.</li>
	<li>Resuspender las piezas en tampón de disociación 1 que contiene tripsina C-0,05% EDTA al 0,02% durante 10 min a 37 °C con agitación (180 rpm). Lavar inmediatamente con un 10% de medio de Eagle modificado de FBS/Dulbecco (DMEM). Centrifugar durante 5 min a 350 g a 4 °C.</li>
	<li>Lavar de nuevo resuspendiendo el pellet en 10 ml de tampón de lavado y centrifugando a 350 x g durante 5 min a 4 °C antes del siguiente paso de disociación.</li>
	<li>Incubar el páncreas en tampón de disociación 2 durante 15 min a 37 °C con agitación (180 rpm).</li>
	<li>Después de 15 minutos, realice la disociación mecánica pipeteando vigorosamente los fragmentos pancreáticos hacia arriba y hacia abajo en pipetas estériles de tamaño decreciente (pipetas serológicas de 25, 10 y 5 ml) 10 veces y vuelva a llevar a 37 °C.<ol><li>Después de 5 minutos adicionales, repita la disociación mecánica y use microscopía óptica para monitorear la disociación de acuerdo con la cantidad de suspensión de una sola célula. Por lo general, si en esta etapa, menos del 90% de la suspensión consiste en células individuales aisladas, se necesita un tiempo de incubación más largo. Use azul de tripano para monitorear la viabilidad celular.</li>
		<li>Continuar con la incubación y tomar muestras para detectar la disociación cada 5 min. NOTA: El tiempo total de incubación depende del tejido y puede variar entre muestras. La incubación y la disociación tisular deben terminar cuando el 90% de las células se separan en células individuales o cuando se detecta una reducción de la viabilidad.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de que el tejido pancreático esté bien disociado (lo que corresponde a la desaparición de los fragmentos pancreáticos y al aumento de la turbidez de la solución) (Figura 2), detener la reacción enzimática lavando dos veces con la solución de parada de actividad enzimática durante 5 min a 4 °C. A partir de este paso, mantenga la suspensión celular en hielo.</li>
	<li>Pase la suspensión celular a través de una malla de nailon de 70 μm y verifique la viabilidad celular bajo el microscopio. Los tamaños más pequeños de malla de nailon pueden reducir la viabilidad celular.</li>
	<li>Vuelva a suspender y lave el gránulo con 5-10 ml de solución de lavado tamponada helada. Cuenta las celdas.</li>
	<li>Si se observan varios glóbulos rojos, trátelos con un tampón de lisis de glóbulos rojos durante 2 minutos a temperatura ambiente. En los casos en que se observen grumos, la muestra debe tratarse de nuevo con tripsina, como se describe en el paso 2.5. La viabilidad se detecta con azul de tripano bajo el microscopio, y si la viabilidad es inferior al 80%, las células vivas deben aislarse utilizando el kit de eliminación de células muertas de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) con columnas MACS MS (ver Tabla 1).</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+single-cell+RNA-seq+highlights+intra-tumoral+heterogeneity+and+malignant+progression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cell Research. 29 (9), 777(2019).</li>
<li>Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+progression+in+the+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetic progression in the pancreatic ducts.</a> The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).</li>
<li>Schlesinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+pancreatic+preinvasive+lesions+and+cancer+reveal+acinar+metaplastic+cells%27+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity.</a> Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).</li>
<li>Kolodkin-Gal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senolytic+elimination+of+Cox2-expressing+senescent+cells+inhibits+the+growth+of+premalignant+pancreatic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions.</a> Gut. 71 (2), 345-355 (2021).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li>
<li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li>
<li>Bernard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+pancreatic+cancer+precursors+demonstrates+epithelial+and+microenvironmental+heterogeneity+as+an+early+event+in+neoplastic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression.</a> Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).</li>
<li>Moncada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+microarray-based+spatial+transcriptomics+and+single-cell+RNA-seq+reveals+tissue+architecture+in+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas.</a> Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptome+profiling+of+pancreatic+cancer+identifies+multicellular+dynamics+associated+with+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment.</a> Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).</li>
<li>Cui Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+drivers+and+transitional+cell+populations+cooperate+with+the+microenvironment+in+untreated+and+chemo-resistant+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

En este artículo, presentamos un protocolo para la disociación del tejido pancreático. El protocolo es simple, fácil de usar y proporciona una herramienta para aislar células individuales viables del tejido pancreático en diferentes etapas durante el proceso de malignidad, incluidos los tumores sólidos. En estudios previos, se utilizaron diferentes tipos de colagenasas para digerir el páncreas 8,9. El uso de una colagenasa muy potente, como la colagenasa D, da co...

El adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) es uno delos tipos de cáncer más agresivos. La evidencia clínica apoya la idea de que el PDAC se desarrolla a partir de células del sistema exocrino, incluidas las células acinares, a lo largo de muchos años, impulsadas por mutaciones en el protooncogén KRAS2.
Los tumores de páncreas incluyen muchos tipos de células diferentes, y se ha demostrado que las células malignas representan solo el 20%-50% dela masa tumoral. Los diferentes tipos de células interactúan con las células epiteliales, apoyan su transformación y mejoran la formación y el crecimiento de tumores. Los eventos tempranos causan metaplasia acinar, que da lugar a lesiones microscópicas llamadas neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), que en algunos casos pueden convertirse en PDAC4.
Existe una necesidad crítica de investigar estas interacciones y apuntar a las señales fundamentales. La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) es un método potente que revela la expresión génica con una resolución de una sola célula, rastreando así los cambios que experimentan las células epiteliales, lo que permite explorar el desarrollo del cáncer de páncreas. 
La disección de tejidos y la digestión de células individuales es la primera etapa de un experimento scRNA-seq. Varios factores hacen que la digestión del tejido pancreático sea especialmente difícil: i) las células acinares representan más del 90% del páncreas y las células acinares contienen grandes cantidades de enzimas digestivas, incluidas proteasas y RNasas que reducen la calidad de las bibliotecas basadas en ARN; ii) las células acinares son muy sensibles y pueden lisarse si se utilizan protocolos normalizados; (iii) las células acinares expresan un pequeño número de genes a niveles muy altos. Por lo tanto, si estas células se lisan durante el experimento, esto puede contaminar el perfil de expresión génica observado de otras células; (iv) El tejido pancreático recuperado de los tumores es desmoplásico, lo que dificulta su disección sin dañar las células. Por lo tanto, aunque se requiere mantener una alta viabilidad de todos los tipos de células, el gran número y la sensibilidad de las células acinares añaden complejidad adicional. Estos factores imponen dificultades para lograr una suspensión unicelular que sea viable en más del 80% y no tenga grumos, como se requiere para los experimentos de scRNA-seq. 
En este caso, desarrollamos un protocolo con tripsina C y colagenasa P, junto con una monitorización frecuente de los tejidos. Esto apoya la disociación a células individuales al tiempo que conserva una alta viabilidad para respaldar el éxito de los experimentos de scRNA-seq 5,6.

<table><tbody><tr><td>Reactivo o Recurso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m malla de nylon&nbsp;</td><td>Gato Corning</td><td>##431751</td><td></td></tr><tr><td>Gato BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td># A7906</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa P</td><td>Gato Roche</td><td># 11213857001</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo</td><td></td><td></td><td></td>Comercial Crítico</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>gato#MBD0015</td><td></td></tr><tr><td>Gato Dnase I</td><td>Roche</td><td># 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Modelos Experimentales: Organismos/ Cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino ThermoFisher sudamericano</td><td>Cat</td><td>#10270106</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks</td><td>Industrias biológicas</td><td>cat#02-018-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KRASLSL-G12D ratones</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX008179</td><td></td></tr><tr><td>MACS kit de eliminación de células muertas</td><td>Milteny Biotec</td><td>cat#130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Industrias biológicas</td><td>cat#02-023-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER ratones</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>JAX019378</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomate ratones</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>JAX007908</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina C-EDTA 0.05%</td><td>Industrias biológicas</td><td>cat# 03-053-1A Tripsina</td><td></td></tr><tr><td> inhibidor</td><td>Roche</td><td>gato#T6522</td><td></td></tr></tbody></table>

disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

El páncreas incluye dos sistemas principales: el sistema endocrino, que produce y secreta hormonas, y el sistema exocrino, que representa aproximadamente el 90% del páncreas e incluye células que producen y secretan enzimas digestivas. Las enzimas digestivas se producen en las células acinares pancreáticas, se almacenan en vesículas llamadas zimógenos y luego se liberan en el duodeno a través del conducto pancreático para iniciar los procesos metabólicos. Las enzimas producidas por las células acinares pueden matar células o degradar el ARN libre de células. Además, las células acinares son frágiles, y los protocolos de disociación comunes dan como resultado un gran número de células muertas y proteasas y RNasas libres de células. Por lo tanto, uno de los mayores desafíos en la digestión del tejido pancreático es recuperar las células intactas y viables, especialmente las células acinares. El protocolo presentado en este artículo muestra un método de dos pasos que desarrollamos para satisfacer esta necesidad. El protocolo se puede utilizar para digerir el páncreas normal, el páncreas que incluye lesiones premalignas o los tumores pancreáticos que incluyen un gran número de células estromales e inmunitarias.

En un trabajo publicado recientemente5, aplicamos el protocolo descrito anteriormente para explorar las primeras etapas del desarrollo de PDAC utilizando un modelo de ratón. El ratón fue modificado genéticamente para incluir los casetes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, que permiten la expresión de KRAS constitutivamente activo en células acinares después de la inyección de tamoxifeno.
Después...

Las células metaplásicas pancreáticas son precursoras de células malignas que dan lugar a tumores pancreáticos. Sin embargo, aislar células pancreáticas viables intactas es un desafío. Aquí, presentamos un método eficiente para la disociación del tejido pancreático. A continuación, las células pueden utilizarse para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) o para el cocultivo bidimensional o tridimensional.

Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

El protocolo de disociación del tejido pancreático demostrado es simple y proporciona una herramienta para aislar células individuales viables del tejido pancreático en diferentes etapas durante el proceso de malignidad, incluidos los tumores sólidos. La recuperación de células acinares intactas y viables es un reto importante. El protocolo puede recuperar células individuales viables de páncreas normal, páncreas con lesiones premalignas o tumores pancreáticos que contienen numerosas células estromales e inmunitarias.El uso de este protocolo para diseccionar tumores de páncreas humanos o páncreas inflamado podría ayudar en la investigación de estas enfermedades para encontrar nuevos biomarcadores y tratamientos. El método es fácil de usar y puede proporcionar los resultados deseados con un mínimo de práctica. Este video ayudará a ver los pequeños detalles del protocolo.Antes de comenzar la disección, mantenga todos los instrumentos y equipos listos en hielo. Después de fijar al ratón sacrificado, rocíe su abdomen con etanol al 70%. Con ayuda de unas tijeras y unas pinzas, haz una incisión en forma de V de 2,5 centímetros en la zona genital del animal, y procede hacia arriba para abrir completamente la cavidad abdominal.Localiza el estómago en el lado izquierdo del ratón y el páncreas, que está cerca del bazo. Con dos fórceps, separe el páncreas del estómago y el duodeno sin desgarrarse. Continúe y separe el páncreas del intestino delgado, el yeyuno y el íleon.Mueva el páncreas hacia el lado derecho y separe las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica con fórceps para separar completamente el páncreas y el bazo adjunto. Con cuidado, retire el páncreas sin grasa mesentérica u otro tejido adyacente, y extiéndalo para examinarlo en una placa de Petri con hielo. Siguiendo la composición mencionada en el texto, prepare los tampones de disociación 1 y 2, el tampón de lavado y la solución de parada de actividad enzimática con anticipación.Coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros sobre hielo y enjuáguelo con suero bovino fetal al 10%, o FBS, y solución salina equilibrada de Hank, o HBSS. La grasa flotará y el páncreas se hundirá. Esta es una manera fácil de visualizar y eliminar rápidamente el tejido adiposo blanco contaminante que aún está adherido al páncreas.A continuación, transfiera y mantenga el tejido pancreático de ratón en una placa de Petri estéril que contenga cinco mililitros de HBSS en hielo hasta el corte. Con unas tijeras Noyes y un bisturí, corta el páncreas en trozos pequeños de uno a tres milímetros cúbicos. Después de transferir los tejidos a un tubo de centrífuga, centrifugue a 350 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Aspire y deseche el sobrenadante para eliminar los fragmentos celulares y las células sanguíneas. Suspender, suspender las piezas en tampón de disociación 1 que contiene 0,02% de tripsina-C y 0,05% de EDTA durante 10 minutos a 37 grados centígrados con agitación. Lavar inmediatamente con FBS al 10% y Modified Eagle's Medium, o DMEM, de Dulbecco, y centrifugar durante cinco minutos a 350 g y cuatro grados centígrados.Lavar de nuevo resuspendiendo el gránulo en 10 mililitros de tampón de lavado y centrifugando como antes durante cinco minutos antes del siguiente paso de disociación. Incubar el páncreas en el tampón de disociación 2 durante 15 minutos a 37 grados centígrados con agitación a 180 rotaciones por minuto. Después de 15 minutos, realice la disociación mecánica pipeteando vigorosamente los fragmentos pancreáticos hacia arriba y hacia abajo 10 veces con pipetas serológicas estériles.Repita con pipetas de tamaño decreciente, a partir de 25, 10 y 5 mililitros. Incubar la muestra para llevarla a 37 grados centígrados. Utilice microscopía óptica para controlar la disociación de acuerdo con la cantidad de célula individual en la suspensión.Monitorizar la viabilidad celular utilizando azul de tripano. Continúe la incubación y verifique la disociación tomando muestras cada cinco minutos. Incubar hasta que el 90% de las células se separen en células individuales.Después de que el tejido pancreático esté bien disociado, indicado por la desaparición de fragmentos pancreáticos y el aumento de la turbidez de la solución, detenga la reacción enzimática lavando dos veces con la solución de parada de actividad enzimática durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A partir de este paso, mantenga la suspensión celular en hielo. Pasar la suspensión celular a través de una malla de nylon de 70 micras.Un tamaño de malla de nailon más pequeño puede reducir la viabilidad de la célula. Comprobar la viabilidad celular bajo el microscopio. Vuelva a suspender y lave el gránulo con 5 a 10 mililitros de solución de lavado tamponada helada antes de contar las células.Si se observan varios glóbulos rojos, trátelos con un tampón de lisis de glóbulos rojos durante dos minutos a temperatura ambiente. En los casos en que se observen grumos, las muestras deben ser tratadas de nuevo con tripsina, como se ha descrito anteriormente. Si la viabilidad es inferior al 80%, las células vivas deben aislarse utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente o el kit de eliminación de células muertas MACS con columnas MACS MS.El color rojo del tejido pancreático aislado fue el resultado de la expresión de tdTomato en las células acinares. En una etapa temprana de la disociación, había un bajo número de células aisladas y un gran número de grupos. Posteriormente, se obtuvieron células viables aisladas evitando reducir el número de células viables.Una incubación más prolongada redujo la viabilidad de las células. Las células tdTomato positivas se estimaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia. El protocolo de disociación suave apoyó la recuperación de múltiples tipos de células, con una alta viabilidad que permitió hacer un seguimiento con la clasificación celular de los tipos celulares deseados.El recuento de células vivas a células muertas se realizó con un hemacitómetro. Las imágenes de fluorescencia de las secciones pancreáticas congeladas mostraron las células acinares positivas para tdTomato. La secuenciación de ARN de una sola célula confirmó la detección de todos los tipos de células detectados en la clasificación celular activada por fluorescencia en cada tejido resecado de todos los puntos temporales.Se estudió la expresión de carboxipeptidasa1 o CPA1 en células acinares, lo que indica una contaminación mínima con el transcriptoma de otros tipos celulares. Es importante tener en cuenta que los tiempos de incubación más largos redujeron la viabilidad de las células, por lo que es importante monitorear la muestra y observar la disociación del tejido y la viabilidad celular cada pocos minutos bajo el microscopio. El protocolo de aislamiento celular se puede utilizar para la secuenciación de ARN de una sola célula, el cultivo de células o como material de partida para organoides.Esta técnica permite explorar cómo se desarrolla el cáncer de páncreas e investigar las interacciones entre las células que se infiltran en el tejido inflamado o canceroso.

pancreatic-tissue-dissection-to-isolate-viable-single-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

A continuación, describimos un método para el aislamiento de células en el microambiente de páncreas, tejido de ratón neonatal y adulto embrionario, centrándose en el aislamiento de las células mesenquimales. Este método permite que los perfiles de expresión génica de células y la secreción de proteínas con el fin de dilucidar las señales extrínsecas que regulan el desarrollo del páncreas, la función y la tumorigénesis.

Aislar y analizar células del páncreas mesénquima por Citometría de Flujo

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Este protocolo describe el aislamiento de células endoteliales de ratón de páncreas completo.

Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Aprende a disociar tejido pancreático para aislar células individuales viables de tumores y lesiones pre-malignantes. Este protocolo facilita la investigación de biomarcadores y tratamientos para enfermedades pancreáticas.

Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables

Explorar más videos