Name: Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprenda a cultivar esferoides 3D reproducibles usando un biorreactor y caracterícelos mediante proteómica LC-MS. Este método permite producir cientos de réplicas biológicas simultáneas para estudiar la función celular in vitro.

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El laboratorio de Sidoli agradece a la Fundación para la Investigación de la Leucemia (Beca de Investigación para Nuevos Investigadores Hollis Brownstein), AFAR (premio Sagol Network GerOmics), Deerfield (premio Xseed), Relay Therapeutics, Merck y la Oficina del Director de los NIH (1S10OD030286-01).

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Helle Sedighi Frandsen trabaja como científica investigadora en CelVivo ApS, el productor del sistema ClinoStar. Karoline Mikkelsen es una estudiante de doctorado industrial que trabaja en CelVivo ApS y realiza sus estudios de doctorado en SDU, Odense, Dinamarca. Todos los demás autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Comprender la biología detrás de las estructuras celulares tridimensionales (3D) es extremadamente importante para un conocimiento más completo de sus funcionalidades. Existe un creciente interés en el uso de modelos 3D para estudiar biología compleja y realizar cribados de toxicidad. Al cultivar células en 3D hay que tener en cuenta muchos factores, incluida la evaluación fenotípica del sistema modelo. Un fenotipo se define como un conjunto de características observables de un organismo específico, como la morfología, el comportamiento, las propiedades fisiológicas y bioquímicas20.
En este protocolo, demostramos cómo se pueden realizar experimentos de proteómica a partir de unos pocos esferoides y se pueden usar para monitorear el fenotipo hepático típico. La espectrometría de masas se ha convertido en un método ampliamente aplicado para la caracterización celular en 3D, permitiendo la investigación de una variedad de cuestiones biológicas 12,16,21,22. Para un análisis completo del proteoma, se recomienda utilizar al menos 20 μg de material de partida proteico, de los cuales se inyecta 1 μg en el espectrómetro de masas. Es importante mencionar que agregar menos muestra podría conducir a la pérdida de sensibilidad, y agregar más empeoraría gradualmente la calidad de la cromatografía y, finalmente, conduciría al bloqueo de la columna. En este estudio, demostramos que los esferoides HepG2/C3A y THLE-3 están enriquecidos con proteínas importantes de la glucólisis y del ciclo del TCA, que son vías hepáticas específicas y son críticas para mantener los niveles de glucosa en sangre y para la producción de energía23,24. En realidad, el análisis por espectrometría de masas no solo proporciona información a nivel de proteína, sino que también permite investigar las modificaciones postraduccionales de proteínas, como lo demostró previamente nuestro grupo16.
Otro aspecto a tener en cuenta en los estudios fenotípicos 3D es el número y tamaño de los esferoides. Además de hacer que los experimentos sean más reproducibles, contar el número de esferoides y determinar su tamaño es esencial para determinar cuándo dividir el cultivo en múltiples biorreactores, ya que el número de estructuras 3D dentro de un recipiente puede afectar el tamaño de los esferoides y los niveles de actividad metabólica. Sin embargo, es importante destacar que el número y el tamaño de los esferoides dependen de la línea celular, el número inicial de células, el proceso de división y el momento de la recolección. Los detalles del cultivo de esferoides HepG2/C3A, como el número de células por esferoides, el contenido de proteínas y el tamaño en función de la edad, fueron proporcionados por Fey, Korzeniowska y Wrzesinski25. Para un análisis preciso y exitoso utilizando el método semiautomatizado descrito aquí, el paso más crítico es una buena imagen de los esferoides. Para simplificar, la foto se puede tomar con un teléfono o tableta, pero su resolución debe mantenerse lo más alta posible. Como las imágenes se adquieren rápidamente, permiten realizar experimentos de cribado a gran escala para visualizar características fenotípicas específicas o investigar las respuestas al tratamiento farmacológico. Por lo tanto, debido al creciente número de ensayos basados en células, en los últimos 10 años se han desarrollado varios programas informáticos de código abierto para el análisis de imágenes26. En este protocolo, describimos un sistema semiautomatizado que utiliza el software FIJI18 para contar y medir el tamaño de los esferoides. Presentamos scripts (comandos de programación simples) para definir una secuencia de operaciones algorítmicas que se pueden aplicar a una colección de imágenes, haciendo que el análisis sea un proceso fácil y rápido. Sin embargo, dependiendo de la característica del esferoide, se debe emplear una medición manual. Por ejemplo, si los esferoides son demasiado translúcidos, el script FIJI será impreciso. Por cierto, uno de los criterios más importantes para que este método funcione es la compacidad de los esferoides. Esta característica contribuirá a un contraste de color más mejorado entre los esferoides y el fondo, lo cual es necesario para que el método sea preciso.
En resumen, además de presentar una metodología para el cultivo de esferoides de alta reproducción, también se describió un sistema semiautomatizado acoplado a la caracterización fenotípica mediante captura de imágenes y proteómica. Esperamos que esta caja de herramientas para analizar células 3D sea más robusta con un software de análisis de imágenes totalmente automatizado y espectrómetros de masas de próxima generación.

Se ha demostrado que los cultivos celulares in vitro son necesarios e invaluables para establecer conocimientos fundamentales en biología. Gran parte del conocimiento científico en biología y específicamente en cáncer proviene del sistema de cultivo 2D, es decir, células que crecen en una monocapa. Aunque el cultivo 2D ha sido el sistema de cultivo celular dominante, tiene muchas desventajas que pueden sofocar un mayor progreso biológico. Por ejemplo, los cultivos 2D carecen de interacciones célula-célula importantes para la señalizacióny proliferación celular. Hasta la fecha, se ha demostrado que los sistemas de cultivo 3D modelan mejor la diferenciación, la respuesta a los fármacos, la invasión tumoral y la biología 2,3,4,5. El modelado 3D de cánceres malignos es especialmente vital debido al aumento del envejecimiento de la población y la mortalidad por cáncer. El carcinoma hepatocelular (CHC) es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo y con frecuencia tiene un pronóstico pésimo6. Se sabe que el CHC tiene una baja tasa de curación, una respuesta deficiente a los medicamentos y una alta tasa de recurrencia 6,7,8. Se han desarrollado varios modelos 3D para hígado normal y CHC que imitan la fisiología del tejido hepático normal y maligno in vivo 9,10.
Algunos de los sistemas 3D actuales incluyen recubrimientos de líquidos, biorreactores, hidrogel, andamios y estructuras impresas en 3D. Los esferoides generados en los biorreactores proporcionan específicamente ventajas únicas porque imitan la distribución tumoral de la exposición a nutrientes, el intercambio de gases y la proliferación/quiescencia celular11. Los biorreactores son especialmente adecuados para modelos de cáncer debido a su facilidad de uso, gran escalabilidad, difusión de nutrientes y accesibilidad11. Además, los biorreactores pueden permitir experimentos de alto rendimiento, mayor reproducibilidad y disminución del error humano. El biorreactor utilizado en este estudio es único porque simula un sistema de gravedad reducida, lo que minimiza las fuerzas de cizallamiento disruptivas aplicadas en los biorreactores típicos, lo que permite una mejor reproducibilidad12. La gravedad omnidireccional y la reducción de las fuerzas de cizallamiento permiten que las células se desarrollen de una manera más fisiológica. Como evidencia, las células HepG2/C3A cultivadas bajo esta metodología desarrollan orgánulos esféricos que producen in vivo niveles de ATP, adenilato quinasa, urea y colesterol13,14. Además, los tratamientos farmacológicos en este sistema 3D son más avanzados y automatizados en comparación con los cultivos 2D. En los cultivos 2D, los tratamientos farmacológicos a menudo deben tener un curso de tiempo corto debido a la necesidad de tripsinizar y mantener la salud celular. Sin embargo, en nuestro caso, podemos realizar tratamientos farmacológicos a largo plazo de esferoides sin necesidad de alterar la estructura y la fisiología de las células. Por lo tanto, es necesario pasar de los cultivos 2D a los 3D para modelar mejor los fenómenos biológicos in vivo y seguir desarrollando la ciencia.
En este artículo se presenta una metodología para el cultivo de esferoides de alta reproducibilidad (Figura 1 y Figura 2) y se muestra un sistema semiautomatizado para caracterizar fenotípicamente estructuras 3D (Figura 3). A nivel de imagen, proporcionamos información sobre el conteo y la medición del área de los esferoides (Figura 3). Mediante el uso de métodos de espectrometría de masas, mostramos cómo se puede utilizar la proteómica para evaluar funciones biológicas específicas (Figura 4). Al recopilar y analizar estos datos, esperamos mejorar la comprensión de la biología detrás de los sistemas de cultivo celular en 3D.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>1481754</td><td>Luer punta de bloqueo, graduada a 12 mL</td></tr><tr><td>1000 y micro; Puntas de pipeta de diámetro ancho L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Puntas de pipeta de diámetro ancho L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>placa de filtro Orochem de 96 pocillos</td><td>Orochem&nbsp;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>Placa con faldón de 96 pocillos</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>Colector de vacío de 96 pocillos</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr> Medio de <tr><td>crecimiento de células epiteliales bronquiales (BEGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Biorreactor para cultivo celular 3D</td></tr><tr><td>Incubadora ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>CO2 incubadora para cultivo celular 3D</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia Placa de fijación ultrabaja de fondo redondo de 24 pocillos que contiene micropocillos</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>Incubadora 2 para cultivo celular 2D</td></tr><tr><td>Acetonitrilo de grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol de grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Resin 30 &micro; m</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Espectrómetro de masas Tribrid</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Espectrómetro de masas de alta resolución</td></tr><tr><td>Microscopio PAULA</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Lector de microplacas multietiqueta Victor X2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel pH</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoetanolamina</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Resina Reprosil-Pur</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.003</td><td>120 &Aring; tamaño de poro, fase C18-AQ, 3 &mu; Tamaño de perla</td></tr><tr><td>M SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificada de grado secuencial</td><td>Promega</td><td>V511A</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vacío SpeedVac (placas de 96 pocillos)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Campana estéril</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>S-trap</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de jeringa (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>3" de longitud, 0,05" de diámetro</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3d

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Presentamos un protocolo que describe las propiedades y ventajas del uso de una incubadora de clinostato independiente para el cultivo, tratamiento y monitorización de cultivos celulares en 3D. El clinostato imita un entorno en el que las células pueden ensamblarse como esferoides altamente reproducibles con bajas fuerzas de cizallamiento y difusión activa de nutrientes. Demostramos que tanto los hepatocitos cancerosos como los no cancerosos (líneas celulares HepG2/C3A y THLE-3) requieren 3 semanas de crecimiento antes de alcanzar funcionalidades comparables a las de las células hepáticas. Este protocolo destaca la conveniencia de utilizar incubadoras para células 3D con cámaras que monitorean el crecimiento celular, ya que se pueden tomar instantáneas para contar y medir los esferoides durante el tratamiento. Describimos la comparación de las líneas celulares THLE-3 y HepG2/C3A, mostrando cómo se pueden cultivar líneas celulares no cancerosas, así como células cancerosas inmortalizadas. Demostramos e ilustramos cómo se pueden llevar a cabo experimentos de proteómica a partir de unos pocos esferoides, que se pueden recolectar sin perturbar la señalización celular, es decir, sin necesidad de tripsinización. Demostramos que el análisis proteómico se puede utilizar para monitorear el fenotipo hepático típico del metabolismo de la cadena respiratoria y la producción de proteínas involucradas en la desintoxicación de metales y describimos un sistema semiautomatizado para contar y medir el área del esferoide. En conjunto, el protocolo presenta una caja de herramientas que comprende una caracterización fenotípica a través de la captura de imágenes y una línea de proteómica para experimentar en modelos de cultivo celular en 3D.

En este protocolo, describimos las propiedades de una innovadora incubadora de células 3D libre de estrés, un sistema diseñado específicamente para el cultivo de esferoides 3D (Figura 2). Optimizamos el protocolo para el cultivo 3D de las líneas celulares THLE-3 y HepG2/C3A. El protocolo descrito aquí es fácil de usar y permite la reproducibilidad y el cultivo rentable de &gt; 100 esferoides por biorreactor. Una vez en el biorreactor, los esferoides se tratan de manera similar a las células mantenidas en cultivo 2D. Las condiciones óptimas de crecimiento se logran intercambiando los medios dos o tres veces por semana (Figura 2B) y ajustando la velocidad de rotación de acuerdo con el crecimiento y el tamaño de los esferoides (Figura 2C). Este sistema, en el que los esferoides 3D se cultivan en biorreactores rotativos (Figura 2E, F), proporciona un entorno de crecimiento óptimo para las estructuras 3D al exponer el esferoide a una cantidad igual y muy baja de fuerza de cizallamiento.
Anteriormente hemos mostrado cómo se pueden utilizar los esferoides para el análisis de la modificación de la cromatina16. Aquí, demostramos en detalle cómo obtener esferoides hepáticos y cómo se pueden realizar experimentos de proteómica para el análisis del proteoma completo (Figura 1). En resumen, el protocolo se inició mediante el uso de células planas THLE-3 o HepG2/C3A hasta que el cultivo alcanzó el 80% de confluencia. Para cultivar células como esferoides, aproximadamente 2.000 células se colocaron en una placa de fijación ultra baja que contenía micropocillos para permitirles autoagregarse, y luego, los esferoides formados se transfirieron a un biorreactor (Figura 1A). A pesar de que son funcionalmente activos después de 3 semanas en cultivo, como se demostró previamente17, mostramos resultados de esferoides recolectados después de 36 días en cultivo para este protocolo. Después de la recolección, los esferoides se centrifugaron y tanto los gránulos como el sobrenadante se almacenaron para su análisis. La viabilidad celular fue evaluada a partir del sobrenadante para la cuantificación de la adenilato quinasa liberada por las células dañadas, como se describió previamente17. Las proteínas celulares se extrajeron del gránulo celular y el proteoma completo se analizó mediante espectrometría de masas de alta resolución (Figura 1B).
Este protocolo también demuestra un método semiautomatizado para el conteo de esferoides (Figura 3A) utilizando el programa de procesamiento de imágenes públicas FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Para el análisis se debe tomar una imagen de buena calidad del esferoide y se deben considerar algunos parámetros como se menciona en la sección 5. A continuación, después de preparar la imagen para el análisis, se utiliza un script de macros (Archivo suplementario 1) para contar los esferoides. La macro funciona creando primero una carpeta llamada FIJI Spheroids counting, dentro de la carpeta donde se encuentran las imágenes de esferoides. En esta carpeta, se guarda toda la información del análisis; esto incluye una imagen de los esferoides que se contaron, con un número de identificación en cada esferoide. También incluye un archivo de Excel llamado conteo de esferoides. Este archivo contiene el área de píxeles y el número de identificación de cada esferoide que se ha contado. Los datos correspondientes a una imagen analizada se presentan en cada pestaña del archivo. La pestaña está etiquetada de acuerdo con el nombre de la imagen analizada. Dado que el tamaño de los esferoides puede verse afectado por muchos factores, incluido el número de estructuras dentro de un vaso y el tratamiento farmacológico, también es importante controlar su superficie (planimetría). El script de macros que se presenta aquí (Archivo Suplementario 2) funciona midiendo las áreas negras, que corresponden a los esferoides de la imagen (Figura 3B). La salida se recopila en un archivo llamado planimetría.xlsx, que contiene el área medida, el perímetro y el diámetro de cada esferoide. También existe una medida llamada Feret, que se utiliza para calcular el diámetro. Feret es el diámetro más largo posible, mientras que minFeret es el más corto. El diámetro es el promedio de estos dos. Dentro de la carpeta de salida, además del archivo planimetría .xlsx, también hay una imagen de los esferoides que se midieron.
Antes de proceder al análisis del proteoma, se evaluó la viabilidad de los esferoides a lo largo del tiempo de cultivo. Los niveles de AK aumentan hasta el día 17, alcanzando aproximadamente el 7% de la muerte celular, y luego la muerte disminuye a niveles inferiores al 5% (Figura 4A), lo que concuerda con el trabajo publicado previamente17. Este protocolo también muestra el análisis completo del proteoma para monitorizar el fenotipo celular. En primer lugar, se compararon los proteomas de las células planas THLE-3 y HepG2/C3A y los esferoides. Al analizar el primer componente principal (PC1), es evidente que existe una estricta separación de las muestras de esferoides de los cultivos celulares planos, y parece que la correlación del tipo de célula (THLE-3 y HepG2/C3A) no es relevante (Figura 4B). Aunque los esferoides THLE-3 y HepG2/C3A no se agrupan, comparten perfiles similares consistentes con la función hepática. Demostramos en este protocolo el ejemplo de las metalotioneínas, que tienen un papel en la desintoxicación de metales realizada por el hígado. En el análisis proteómico identificamos 2 isoformas sobreexpresadas en esferoides en comparación con células planas (MT1E y MT1X) (Figura 4C). También mostramos el enriquecimiento de Gene Ontology (GO) de ambas líneas celulares cultivadas como esferoides. El proceso metabólico de los hidratos de carbono, que comprende el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA), la cadena de transporte de electrones (respiración celular) y el metabolismo del piruvato, es un término frecuente y está enriquecido en los esferoides HepG2/C3A y THLE-3 (Figura 4D,E). La desintoxicación celular, los ácidos grasos y el metabolismo del colesterol son otras funciones enriquecidas en ambos esferoides. Juntas, se sabe que estas funciones son cruciales para la función hepática.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo para el cultivo de esferoides y la preparación de muestras . (A) Enfoque experimental de cultivo celular en 3D. Los cultivos celulares planos en la confluencia deseada se tripsinizaron y se sembraron en una placa de 24 pocillos de fijación ultra baja que contenía micropocillos, donde las células se autoensamblan en esferoides. Después de 24 h, los esferoides se transfirieron a un biorreactor y se cultivaron hasta que estuvieron listos para el análisis. (B) Después de la recolección, los esferoides se peletizaron y tanto el gránulo como el sobrenadante de cultivo se almacenaron hasta su procesamiento. Se extrajeron las histonas16y las proteínas no histonas, se digierieron en péptidos y se analizaron mediante espectrometría de masas de alta resolución. Los archivos sin procesar obtenidos de la espectrometría de masas se buscaron en la base de datos humana y los datos se procesaron posteriormente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Figura 2: Sistema de cultivo celular 3D . (A) Partes del biorreactor. El biorreactor está compuesto por una cámara de intercambio de gases y humidificación que contiene perlas de agua y una cámara celular que se puede abrir con dos tapones para el intercambio de medios y la recolección de esferoides. (B) Intercambio de medios de biorreactores. El biorreactor se llena con 10 ml de medio de crecimiento utilizando una jeringa con una aguja. (C) La aplicación de control del sistema. La velocidad de rotación, el nivel de CO2, la temperatura, el registro de alarmas y otras funcionalidades se pueden controlar mediante la unidad de control. (D) Colocación del biorreactor en la incubadora 3D. Cada biorreactor tiene un motor asociado que puede hacer girar el biorreactor lentamente. (E) Biorreactor en movimiento con la velocidad (rpm) controlada por una tableta (C). La velocidad (rpm) se ajusta de acuerdo con el tamaño de los esferoides. (F) Biorreactores dentro de la incubadora 3D. La incubadora 3D puede albergar hasta 6 biorreactores controlados individualmente. Foto cortesía de Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Figura 3: Caracterización fenotípica de esferoides mediante captura de imágenes . (A) Recuento semiautomatizado de esferoides. Después de tomar instantáneas de los esferoides en el biorreactor, la imagen se prepara para su análisis en FIJI. Se cuenta cada esferoide y se proporciona un número de identificación para cada uno de ellos. Se utiliza una macro y los resultados se muestran mostrando el identificador del esferoide contado, la etiqueta (nombre de la imagen que se analizó) y el área (el número de píxeles contados en el esferoide). (B) Determinación planimétrica del área esferoide. Con una macro, se determinan el área, el perímetro y el diámetro de un esferoide específico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Figura 4: Análisis del proteoma de los esferoides hepáticos. (A) La viabilidad de los esferoides se calculó a partir de la liberación de adenilato quinasa (AK) en el sobrenadante del cultivo. Los resultados son las medias de los puntos de datos duplicados ± DE. (B) Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para comparar el proteoma de las células planas y esferoides THLE-3 y HepG2/C3A. (C) Abundancia relativa de metalotioneínas, que son proteínas expresadas por el hígado humano. Los datos se representan como medios ± SEM. (D) Las redes agrupadas funcionalmente muestran el enriquecimiento de GO para los esferoides HepG2/C3A y (E) los esferoides THLE-3, donde solo se muestra la etiqueta del término más significativo por grupo. La red se construyó utilizando ClueGo19. El tamaño del nodo representa la importancia del enriquecimiento del término. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Script de macros para el conteo de esferoides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Macro para la determinación planimétrica de esferoides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Presentamos un protocolo para el cultivo de esferoides de alta reproducibilidad y su caracterización fenotípica mediante captura de imágenes y proteómica.

Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Este protocolo demuestra cómo cultivar esferoides altamente reproducibles y muestra cómo se pueden realizar experimentos proteómicos para caracterizar la función biológica de las estructuras 3D. Nuestro cultivo 3D puede producir simultáneamente cientos de réplicas biológicas en el mismo biorreactor, y el enfoque LC-MS puede medir la abundancia de miles de proteínas en un solo experimento. Stephanie Stransky, una postdoc del laboratorio, demostrará el procedimiento.Para comenzar, tome la suspensión de las células HepG2/C3A y THLE-3. Contar el número de células y diluir la suspensión celular en medios de crecimiento completos para obtener 1 millón de células en un volumen máximo de 1,5 mililitros. Lave los pocillos de una placa inferior redonda de 24 pocillos con 0,5 mililitros de sustrato y centrifugue a 3.000 g durante cinco minutos.Transfiera la suspensión celular a la placa y centrifugue durante tres minutos a 120 g. Luego, incube la placa para iniciar la formación de esferoides. A continuación, equilibre el biorreactor 24 horas antes de transferir los esferoides llenando la cámara de humedad con 25 mililitros de agua estéril y la cámara celular con nueve mililitros de medio de crecimiento utilizando una jeringa de 10 mililitros con una aguja larga.Luego, coloque el biorreactor en una incubadora 3D durante 24 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Pipetear suavemente los esferoides hacia arriba y hacia abajo con puntas de un mililitro de diámetro ancho para separarlos de la placa de fijación ultra baja y transferirlos a una placa de cultivo de tejidos. Para capturar los esferoides restantes, lave la placa con 0,5 mililitros de medio de cultivo precalentado y transfiéralos a la placa de cultivo.Usando un microscopio óptico, evalúe el tamaño, la compacidad y la redondez de los esferoides para seleccionar los que están adecuadamente formados. Transfiera el esferoide seleccionado al biorreactor de equilibrio lleno de cinco mililitros de medios de cultivo frescos. A continuación, llene todo el biorreactor con medios de cultivo nuevos.Coloque el biorreactor en la incubadora 3D y ajuste la velocidad de rotación con la unidad de control. Reemplace 10 mililitros de sustrato viejo por 10 mililitros de sustrato nuevo cada dos o tres días. Cambie la velocidad de rotación cada vez que reemplace el medio.Cultive los esferoides durante 15 días y divídalos entre dos biorreactores frescos. Abra la aplicación 3D instalada en la tableta, seleccione el biorreactor y capture la imagen. Como alternativa, coloque un fondo negro detrás del biorreactor y asegúrese de que la luz no se refleje en la cámara celular.Capture la imagen lo más cerca posible del biorreactor. Luego, recoja los esferoides retirando cinco mililitros de medio del biorreactor con una jeringa conectada a una aguja larga a través del puerto superior. Asegúrese de que los esferoides desciendan al centro inferior del biorreactor.Ahora, abra el puerto frontal y recoja los esferoides con una punta de un mililitro de diámetro ancho. Transfiera estos esferoides a tubos de microcentrífuga, centrifugue a 500 g durante cinco minutos y deseche los medios. Lave el esferoide agregando 200 microlitros de HBSS para eliminar el FBS.Después de esto, realice la centrifugación a 500 g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Luego, sumerja el gránulo de esferoide rápidamente en nitrógeno líquido para congelarlo y almacene este gránulo congelado a menos 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para lisar las células, tome un tubo de esferoides recolectados y vuelva a suspenderlos en 25 microlitros de SDS al 5%.Homogeneizar el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, disuelva un microgramo de muestras y 10 microlitros de ácido tricloroacético al 0,1%. Después de extraer la proteína y limpiar las muestras, configure el método de adquisición de MS para generar los espectros de MS/MS a partir de las señales peptídicas identificadas.A continuación, transfiera la placa al muestreador automático de cromatografía líquida de nanolitros. Establezca el escaneo MS completo en una relación masa-carga de 300 a 1, 100 en el Orbitrap. Ajuste la resolución a 120000 y establezca el objetivo de control automático de ganancia en 125.A continuación, configure MS/MS en el Orbitrap con una ventana de aislamiento secuencial de 50 de relación masa-carga. Apunte el objetivo de control automático de ganancia a 400 y establezca una energía de disociación colisional de mayor energía de 30. Según el análisis de viabilidad de los esferoides, los niveles de adenilato quinasa aumentan hasta el día 17, lo que resulta en alrededor del 7% de la muerte celular.Posteriormente, la tasa de mortalidad disminuye por debajo del 5%Además, un análisis del primer componente principal revela una clara distinción entre muestras de esferoides y cultivos celulares planos. El análisis proteómico indicó que los esferoides THLE-3 y HepG2/C3A tienen perfiles similares que reflejan la función hepática. Además, los esferoides mostraron sobreexpresión de dos isoformas de metalotioneínas en comparación con las células planas.Las redes agrupadas funcionalmente mostraron un enriquecimiento de la ontología génica para el proceso metabólico de carbohidratos en las esferas HepG2/C3A y THLE-3. Para evitar que el medio de crecimiento se derrame, no abra ni cierre el puerto frontal cuando la cámara celular esté completamente llena de líquido. La preparación y el análisis de muestras descritos en este protocolo se pueden utilizar para explorar el proteoma del cultivo de células utilizando métodos 2D y 3D, así como muestras de tejido.

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Research

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Biochemistry

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