Name: Visualización y cuantificación del emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres de ARN in vitro utilizando reporteros de ARN brócoli dividido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprende a detectar y cuantificar el emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres in vitro utilizando el sistema de aptámero Broccoli dividido. Este método de fluorescencia permite evaluar directamente las interacciones ARN-ARN.

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	<li>Jain, A., Vale, R. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+phase+transitions+in+repeat+expansion+disorders.">RNA phase transitions in repeat expansion disorders.</a> Nature. 546, 243-247 (2017).</li><li>Langdon, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+structure+determines+specificity+of+a+polyQ-driven+phase+separation.">mRNA structure determines specificity of a polyQ-driven phase separation.</a> Science. 360, 922-927 (2018).</li><li>Tauber, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+RNA+condensation+by+the+DEAD-box+protein+eIF4A.">Modulation of RNA condensation by the DEAD-box protein eIF4A.</a> Cell. 180, 411-426 (2020).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+intermolecular+base+pairing+in+Drosophila+germ+granules+by+mRNA+folding+and+its+implications+in+fly+development.">Controlling intermolecular base pairing in Drosophila germ granules by mRNA folding and its implications in fly development.</a> Nat Commun. 16, 8135 (2025).</li><li>Van Treeck, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+self-assembly+contributes+to+stress+granule+formation+and+defining+the+stress+granule+transcriptome.">RNA self-assembly contributes to stress granule formation and defining the stress granule transcriptome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115, 2734-2739 (2018).</li><li>Bose, M., Rankovic, B., Mahamid, J., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+architectural+role+of+specific+RNA&#8211;RNA+interactions+in+oskar+granules.">An architectural role of specific RNA&#8211;RNA interactions in oskar granules.</a> Nat Cell Biol. 26, 1934-1942 (2024).</li><li>Jambor, H., Brunel, C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+oskar+3&#8242;+UTRs+promotes+hitchhiking+for+RNA+localization+in+the+Drosophila+oocyte.">Dimerization of oskar 3&#8242; UTRs promotes hitchhiking for RNA localization in the Drosophila oocyte.</a> RNA. 17, 2049-2057 (2011).</li><li>Majumder, S., Coupe, S., Fakhri, N., Jain, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-encoded+intermolecular+base+pairing+modulates+fluidity+in+DNA+and+RNA+condensates.">Sequence-encoded intermolecular base pairing modulates fluidity in DNA and RNA condensates.</a> Nat Commun. 16, 4258 (2025).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensates+in+RNA+repeat+sequences+are+heterogeneously+organized+and+exhibit+reptation+dynamics.">Condensates in RNA repeat sequences are heterogeneously organized and exhibit reptation dynamics.</a> Nat Chem. 14, 775-785 (2022).</li><li>Poudyal, R. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequence+and+structure+control+assembly+and+function+of+RNA+condensates.">RNA sequence and structure control assembly and function of RNA condensates.</a> RNA. 27, 1589-1601 (2021).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2&#8242;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2&#8242;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nat Protoc. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Zubradt, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMS-MaPseq+for+genome-wide+or+targeted+RNA+structure+probing+in+vivo.">DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo.</a> Nat Methods. 14, 75-82 (2017).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+simulations+for+RNA+folding+in+mixtures+of+monovalent+and+divalent+cations.">Theory and simulations for RNA folding in mixtures of monovalent and divalent cations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116, 21022-21030 (2019).</li><li>Maity, H., Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odd&#8211;even+disparity+in+the+population+of+slipped+hairpins+in+RNA+repeat+sequences+with+implications+for+phase+separation.">Odd&#8211;even disparity in the population of slipped hairpins in RNA repeat sequences with implications for phase separation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120, e2301409120 (2023).</li><li>Liao, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intermolecular+base+pairing+using+AMT+crosslinking+in+mammalian+cells+during+oxidative+stress.">Characterization of intermolecular base pairing using AMT crosslinking in mammalian cells during oxidative stress.</a> bioRxiv. , (2025).</li><li>Kirsch, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+the+detection+of+mRNA&#8211;sRNA+interactions+using+AMT-crosslinking+in+vitro.">A streamlined protocol for the detection of mRNA&#8211;sRNA interactions using AMT-crosslinking in vitro.</a> Biotechniques. 67, 178-183 (2019).</li><li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+eukaryotic+RNA+interactomes+reveals+principles+of+higher-order+organization+and+regulation.">In vivo mapping of eukaryotic RNA interactomes reveals principles of higher-order organization and regulation.</a> Mol Cell. 62, 603-617 (2016).</li><li>Alam, K. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+split+aptamer+for+visualizing+RNA&#8211;RNA+assembly+in+vivo.">A fluorescent split aptamer for visualizing RNA&#8211;RNA assembly in vivo.</a> ACS Synth Biol. 6, 1710-1721 (2017).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+transcription+of+nucleic+acids+with+efficient+T7+promoters.">Maximizing transcription of nucleic acids with efficient T7 promoters.</a> Commun Biol. 3, 439 (2020).</li><li>Imburgio, D., Rong, M., Ma, K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+promoter+recognition+and+start+site+selection+by+T7+RNA+polymerase+using+a+comprehensive+collection+of+promoter+variants.">Studies of promoter recognition and start site selection by T7 RNA polymerase using a comprehensive collection of promoter variants.</a> Biochemistry. 39, 10419-10430 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Shanaa, O. A., Rumyantsev, A., Sambuk, E., Padkina, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+production+of+RNA+aptamers+and+nanoparticles:+problems+and+prospects.">In vivo production of RNA aptamers and nanoparticles: problems and prospects.</a> Molecules. 26, (2021).</li><li>Rangan, P., DeGennaro, M., Jaime-Bustamante, K., Coux, R. X., Martinho, R. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+control+of+germ-plasm+RNAs.">Temporal and spatial control of germ-plasm RNAs.</a> Curr Biol. 19, 72-77 (2009).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+self-assembly+of+germ+granule+mRNAs+into+homotypic+clusters.">Sequence-independent self-assembly of germ granule mRNAs into homotypic clusters.</a> Mol Cell. 78, 941-950 (2020).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViennaRNA+package+2.0.">ViennaRNA package 2.0.</a> Algorithms Mol Biol. 6, 26 (2011).</li><li>Filonov, G. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> J Am Chem Soc. 136, 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+Spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of Spinach.</a> J Am Chem Soc. 136, 1198-1201 (2014).</li><li>Guet, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Spinach-tagged+RNA+and+gene+localization+to+image+gene+expression+in+live+yeast.">Combining Spinach-tagged RNA and gene localization to image gene expression in live yeast.</a> Nat Commun. 6, 8882 (2015).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E2756-E2765 (2015).</li><li>Zinskie, J. A., Roig, M., Janetopoulos, C., Myers, K. A., Bruist, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+small+nucleolar+RNA+tagged+with+the+broccoli+aptamer+in+yeast.">Live-cell imaging of small nucleolar RNA tagged with the broccoli aptamer in yeast.</a> FEMS Yeast Res. 18, (2018).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>Un niño con MgCl2</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1028</td><td>Usado para la preparación de 10 y veces; Amortiguador de replegamiento de ARN.</td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>AM9640G</td><td>Usado para la preparación de 10 y veces; Amortiguador de replegamiento de ARN.</td></tr><tr><td>50% PEG 8000</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td>Componente del kit de ligasa de ARN T4; se usó como reactivo de apiñamiento molecular para inducir el agrupamiento de ARN. & nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol absoluto, 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>T038181000CS</td><td>Utilizado para la preparación del tampón de lavado de ARN.</td></tr><tr><td>Ácido fenol:cloroformo, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>AM9722</td><td>Se usa para la purificación de ARN.</td></tr><tr><td>Aminoalil-UTP-Cy5</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-821-CY5</td><td>Se utiliza para el marcaje de ARN durante la transcripción in vitro.</td></tr><tr><td>Tapa de cristal con cámara</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409PK</td><td>Cámara de imagen para reacciones de agrupamiento de ARN.</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>C298-500</td><td>Se usa para la purificación de ARN.</td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>Lucerna</td><td>410</td><td>Utilizado como fluoróforo para la detección de aptámeros de ARN brócoli.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>D12345</td><td>anhidro; grado en biología molecular; utilizado para la preparación del DFHBI-1T. &nbsp;</td></tr><tr><td>ADN Limpio y Kit de concentrador</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td>Se utiliza para la limpieza de productos de ADN antes de la transcripción de T7.</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td>Se usa para extracción de gel.</td></tr><tr><td>Baño seco</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td>Utilizado para calentar muestras de ARN en tubos de microcentrífuga.</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>NIH (Institutos Nacionales de Salud)</td><td>N/A</td><td>software de análisis de imágenes de código abierto; utilizado para la cuantificación de la intensidad de fluorescencia y el análisis de ROI.</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis en gel &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B2-BP</td><td>Se usa para hacer electroforesis en gel de ADN.</td></tr><tr><td>Tinte de carga en gel, morado (6 y más veces)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td>Se utiliza como colorante de carga para la electroforesis en gel de ADN.</td></tr><tr><td>Microscopio de iluminación estructurada instantánea</td><td>VisiTech internacional</td><td>VT-iSIM</td><td>Un microscopio confocal capaz de obtener imágenes de fluorescencia GFP y Cy5.</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>327272500</td><td>Se usa para la purificación de ARN.</td></tr><tr><td>Kit de transcripción MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>AM1334</td><td>Usado para transcripción in vitro de T7. El kit incluye soluciones de nucleótidos (ATP, CTP, GTP, UTP) y DNasa.</td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-284</td><td>tubo de 1,5 mL; utilizado para almacenar plantillas de ADN para transcripción in vitro, productos de ARN y alícuotas de espertina y DFHBI-1T.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Z763845</td><td>Se usa para centrifugación breve.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td>Espectrofotómetro de microvolumen para medir la concentración y calidad del ADN y ARN.</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa y nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>AM9937</td><td>Se utiliza para la resuspensión de bolitas de ARN, preparación de lavado de ARN y buffers de replegamiento, y dilución de espermina y DFHBI-1T.</td></tr><tr><td>Calculadora de masa molar online</td><td>Biolabs de Nueva Inglaterra (NEB)</td><td>N/A</td><td>Herramienta online utilizada para calcular la masa de ARN a partir de la cantidad molar (por ejemplo, pmol).</td></tr><tr><td>Tubos de PCR de polipropileno</td><td>Corning</td><td>3745</td><td>200 & mu; Tubos de L PCR utilizados para PCR, transcripción in vitro y reacciones de agrupamiento de ARN</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación básica PowerPac</td><td>Bio-rad</td><td>1645050</td><td>Se usa para hacer electroforesis en gel de ADN.</td></tr><tr><td>Ciclador térmico Proflex PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44-840-73</td><td>Utilizado para PCR, transcripción in vitro y calentamiento de muestras de ARN en tubos de PCR.</td></tr><tr><td>Q5 Alta Fidelidad 2 veces; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Usado como 2 veces; Mezcla maestra de alta fidelidad.</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada &nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Utilizado para purificación y pelleteo de ARN.</td></tr><tr><td>Solución de descontaminación de RNasa</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>AM9782</td><td>Se utiliza para limpiar bancos de laboratorio y superficies para minimizar la contaminación por RNasa.</td></tr><tr><td>Espermina&nbsp; tetrahidrocloruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141-1G</td><td>Se utiliza para inducir el agrupamiento de ARN.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Utilizado para la preparación del tampón Tris (pH 7,0).</td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp;</td><td>16500500</td><td>Utilizado para electroforesis en gel de ADN.</td></tr></tbody></table>

visualización y cuantificación del emparejamiento de bases de arn intermolecular en clústeres de arn in vitro utilizando reporteros de arn brócoli dividido

Visualization and Quantification of Intermolecular RNA Base Pairing in in vitro RNA Clusters Using Split Broccoli RNA Reporters

Visualización y cuantificación del emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres de ARN in vitro utilizando reporteros de ARN brócoli dividido

RNA clustering, driven by multivalent intermolecular RNA&#8211;RNA interactions, can occur in vitro in the absence of proteins. While chemical probing and ...

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Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y...

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.

La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo

Aquí, se detalla el método de S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH), que permite el genoma de la cartografía de todo el intramolecular y intermolecular RNA-ARN interacciones in vivo . SPLASH puede ser aplicado para estudiar interactones de ARN de organismos incluyendo levaduras, bacterias y seres humanos.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ácido desoxirribonucleico (ADN). Este protocolo describe cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con un 2-paso y enfoque, que es aplicable a cualquier fragmento de ADN de interés basado en la reacción en cadena de polimerasa de 3 pasos (PCR).

Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

El protocolo presenta dos métodos para determinar la cinética de los aptámeros de ARN fluorogénico Spinach2 y Brócoli. El primer método describe cómo medir la cinética del aptámero fluorogénico in vitro con un lector de placas, mientras que el segundo método detalla la medición de la cinética del aptámero fluorogénico en las células mediante citometría de flujo.

Determinación de cinética de encendido in vitro y celular para aptámeros de ARN fluorogénicos

El protocolo proporciona instrucciones para modificar el ARN con sulfato de dimetilo para experimentos de perfiles mutacionales. Incluye sondeo in vitro e in vivo con dos métodos alternativos de preparación de bibliotecas.

Sondeo de la estructura del ARN con perfil mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación in vitro y en células

Establecimos un ensayo de hibridación in situ dúplex para mapear las isoformas de los receptores de insulina IR-A e IR-B en el plexo coroideo murino, superando las limitaciones de los métodos tradicionales. Este enfoque de alta resolución revela la expresión específica de isoformas, ofreciendo nuevos conocimientos sobre la señalización de la insulina en el cerebro y posibles terapias dirigidas a isoformas para trastornos neurológicos.

Visualización precisa de los receptores de insulina A y B en el cerebro murino con un ensayo de hibridación in situ de ARN

Aquí presentamos un protocolo para capturar las interacciones ADN-ADN de cromatina asociadas al ARN para mapear la organización del genoma tridimensional relacionada con el ARN.

Método de interacción ADN-ADN con cromatina asociada a ARN

Aprende a detectar y cuantificar el emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres in vitro utilizando el sistema de aptámero Broccoli dividido. Este método de fluorescencia permite evaluar directamente las interacciones ARN-ARN.

Visualización y cuantificación del emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres de ARN in vitro utilizando reporteros de ARN brócoli dividido (Video) | JoVE Journal

Visualización y cuantificación del emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres de ARN in vitro utilizando reporteros de ARN brócoli dividido

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