Name: Une In Vitro Test dirritation cutanée (SIT) en utilisant le EpiDerm humaine reconstruite épidermique (RHE) Modèle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Découvrez le test d'irritation cutanée EpiDerm utilisant un modèle d'épiderme humain reconstruit. Cette méthode in vitro remplace les tests animaux pour évaluer la sécurité des produits cosmétiques et pharmaceutiques.

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Les auteurs tiennent à remercier ZEBET au BfR (Allemagne), BASF SE (Allemagne), IIVS Inc (USA), Zet-LSL (Autriche) pour participer à étude multicentrique de validation internationale de la SIT à jour EpiDerm (5 ).

Conditionné tissus I. - Jour 0 <ol><li> Dès réception de la PEV EpiDerm SIT-200-kit, vérifier tous les composants du kit pour l'intégrité (pour plus de détails voir le tableau kit de réactifs et équipements spécifiques). </li><li> Pour tous les trois tissus EpiDerm, préparer un stérile 6-même plaque de pré-rempli avec 0,9 ml de milieu de dosage. </li><li> Dans des conditions stériles, ouvrez le sac en plastique contenant la plaque de 24 puits contenant les tissus EpiDerm et enlever la gaze stérile. </li><li> Utilisez une pince stérile pour enlever chaque insert contenant les tissus EpiDerm et le lieu de l'insérer dans le vide de 24 puits à plaques. Durant cette étape, enlever tout reste d'expédition agarose qui adhère à la face externe de l'insert en douceur buvard sur du papier filtre stérile. </li><li> Dans les 5 prochaines minutes, inspecter visuellement les tissus. Ne pas utiliser les tissus défectueux ou tissus qui sont entièrement recouvertes de liquide. </li><li> Aide d'un écouvillon coton-tige stérile, sécher soigneusement la surface des tissus. Essayez de ne pas toucher le tissu directement - les effets capillaires sont suffisants pour éliminer l'humidité de la surface du tissu. </li><li> Après séchage de la surface du tissu, de transfert trois tissus de la rangée supérieure des plaques de 6 puits pré-rempli avec 0,9 mL de milieu de dosage. Communiqué de bulles d'air piégées sous les inserts. </li><li> Placez les plaques de 6 puits contenant les insère dans l'incubateur pendant 60 ± 5 min de pré-incubation à 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR (humidité relative). </li><li> A la fin des années 60 ± 5 min de pré-période d'incubation, transférer les inserts dans les puits supérieures dans les puits inférieurs de la plaque à 6 puits. Placez les plaques de nouveau dans l'étuve (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) pour une nuit de pré-incubation (18 ± 3 h). </li><li> Placez le reste du milieu de dosage dans le réfrigérateur (5 ± 3 ° C). Après la nuit de pré-incubation, les produits chimiques d'essai peut être appliqué aux tissus EpiDerm. Remarque: La procédure de pré-incubation peut être raccourcie en cas de livraison tardive des tissus (par exemple si les tissus arrivent le mercredi au lieu du mardi). </li></ol> II. Exposition aux produits chimiques - Jour 1 <ol><li> Préparer une plaque de 6 puits par produit chimique de test en remplissant la rangée supérieure uniquement avec 0,9 ml par puits de milieu de dosage. </li><li> Environ 5 minutes avant l'exposition prévue aux produits chimiques, enlever les plaques de 6 puits contenant des tissus pré-conditionné de l'incubateur. </li><li> Évaluer la surface des tissus et enlever toute l'humidité à l'aide des conseils de coton stérile. </li><li> Étiqueter tous les couvercles plaque à 6 puits avec les codes de matériel d'essai ou de noms. </li><li> Dose les tissus avec les produits chimiques d'essai à 1 minute d'intervalle pour faciliter le rinçage de la chimie de test après l'exposition. Garder les assiettes avec les tissus dosé dans la hotte stérile, jusqu'à ce que le dernier tissu est dosé. </li><li> Pour tester les produits chimiques liquides, dispenser 30 uL de la solution directement au-dessus du tissu et placer le filet de nylon à la surface des tissus. Si nécessaire, doucement la position du maillage en utilisant l'ampoule dirigée pipette Pasteur en verre. N'appuyez pas sur la surface du tissu. </li><li> Pour les semi-solides essai, l'utilisation d'une pipette volumétrique de dispenser 30 uL directement au-dessus du tissu. Si nécessaire, le répandre chimique avec une pipette Pasteur pour couvrir la surface du tissu, autant que possible. </li><li> Pour les matériaux solides, peu avant l'application de la substance d'essai, humidifier la surface du tissu avec 25 uL de DPBS stérile. Cela permettra d'améliorer de contact de la surface du tissu avec le produit chimique d'essai. Remplissez un 25 mg une cuillère calibrée de demande forte (ou tout autre outil approprié) avec environ 25 mg de matière broyée finement tests. Appliquer le produit chimique d'essai solide à la surface du tissu. Si nécessaire, utilisez une ampoule dirigée pipette Pasteur de vider complètement la cuillère. Secouez la inserts pour améliorer la diffusion de la solide sur la surface. </li><li> Pour les substances de test avec une consistance cireuse, essayer de former un appartement "cookie comme« morceau d'environ 8 mm de diamètre et de le placer au-dessus du tissu, qui a été préalablement mouillée avec du DPBS stérile. Pour améliorer le contact entre substance d'essai et de tissus, alourdir le «cookie» avec un acier inoxydable ou en plastique d'aide. </li><li> Appliquer DPBS que le contrôle négatif et 5% de SDS comme contrôle positif pour les tissus de contrôle. </li><li> Après le dosage du dernier tissu, de transférer toutes les plaques pendant 35 ± 1 minutes à l'incubateur humidifié (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR). </li><li> Après les 35 minutes d'incubation ± 1 à 37 ° C enlever toutes les plaques de l'incubateur. Placer les plaques dans la hotte stérile et attendre une période de 60 minutes d'exposition chimique est terminée pour le premier tissu dosé. </li><li> Ensuite commence la procédure de lavage en utilisant les insérer une par intervalle de temps minute (pour assurancee que la durée totale d'exposition pour chaque insert est de 60 minutes). </li><li> Utilisez une bouteille de lavage pour rincer les tissus avec du DPBS stérile. Remplissez le tissu insert 15 fois en utilisant un flux constant de DPBS et il vide (Remarque:. Pour les tissus avec un filet de nylon, laver la surface du tissu 5 fois et de supprimer le maillage soigneusement avec de l'a souligné, pince forte Ensuite, continuer avec le reste 10 lavages). </li><li> Après le 15 rincez à l'aide de la pissette, immerger complètement l'insert 3 fois 150 ml et DPBS secouer pour enlever le reste du matériel d'essai. </li><li> Enfin, rincez l'insert de tissu fois de l'intérieur et une fois de l'extérieur avec du DPBS stérile. </li><li> Enlever tout excédent de DPBS du tissu en agitant l'insert, et il buvard sur le papier buvard stériles. </li><li> Transférer les inserts de tissu effacé de la nouvelle plaque de 6 puits préalablement pré-remplies avec le milieu. Toutes ces étapes (14-18) doit être fait dans 1 min de chaque insertion. </li><li> Après le dernier tissu est rincé, sécher soigneusement la surface de chaque tissu avec un coton-tige stérile. </li><li> Incuber les tissus dans l'incubateur pour les prochaines 24 ± 2 heures (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR). Remarque: Chaque technicien essai ne doivent pas tester plus de six substances d'essai, y compris les contrôles négatifs et positifs dans une course de test unique (SET), pour être en mesure de suivre le protocole décrit ci-dessous </li></ol> III. D'échange moyen - Jour 2 <ol><li> Après les 24 ± 2 heures post-incubation, transférer les inserts dans la partie inférieure de la plaque de 6 puits, pré-remplis avec 0,9 ml de médias. Media de rangées supérieures peuvent être collectées pour l'analyse des critères d'évaluation supplémentaires (cytokines, chimiokines etc.) L'analyse des critères d'évaluation secondaires est facultative. </li><li> Continuer avec le post-incubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) pendant 18 ± 3 heures. </li></ol> IV. Test de viabilité MTT - Jour 3 <ol><li> Étiquette à deux plaques de 24 puits avec les noms des produits chimiques ou des codes. Une plaque servira pour l'incubation des tissus avec des MTT et l'autre pour l'étape d'extraction. </li><li> Préparer la solution de MTT par le dégel du concentré de MTT (5 mg / ml) et le diluer avec le diluant MTT. La concentration finale de solution de MTT est de 1 mg / ml. </li><li> Pipeter 300 uL de solution de MTT dans chaque puits de la plaque de 24 puits. </li><li> Retirez les plaques de 6 puits de l'incubateur, éponger le fond des inserts sur un papier buvard, et de les transférer dans la plaque de 24 puits pré-rempli avec MTT. </li><li> Placer la plaque de 24 puits dans l'étuve (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) et incuber pendant 3 heures ± 5 min. Respecter strictement les 3 heures ± 5 min le temps d'incubation pour éviter l'écart entre les lectures différentes MTT. </li><li> Lorsque l'incubation MTT est terminée, utilisez une pompe d'aspiration pour aspirer le support doucement MTT de tous les puits. </li><li> Remplir le puits avec du DPBS et aspirer à nouveau. Répétez ceci deux fois plus de rinçage et de s'assurer que les tissus sont secs après l'aspiration dernier. </li><li> Après les lavages de transférer les inserts d'une nouvelle plaque de 24 puits. Plongez délicatement les inserts par pipetage solution 2 ml d'extraction (isopropanol) dans chaque insert. Le niveau va augmenter au-dessus du bord supérieur de l'insert, donc complètement submerger les tissus. </li><li> Sceller la plaque de 24 puits (par exemple avec Parafilm ou en utilisant sac d'étanchéité) pour inhiber l'évaporation d'extraction. Extrait du MTT à partir des tissus d'au moins 2 heures à température ambiante avec agitation douce sur un agitateur plaque (~ 120 rpm). Nuit d'extraction sans secouer peut aussi être utilisé. </li><li> Après la période d'extraction est terminée, percent les inserts avec une aiguille d'injection ou l'ampoule perles pipette Pasteur et de permettre l'extrait de courir dans le puits à partir de laquelle l'insert a été prise. </li><li> Jeter l'insert perforé et une pipette la solution dans le puits de haut en bas trois fois jusqu'à ce qu'elle soit homogène. </li><li> Pour chaque tissu, de transfert à deux aliquots de 200 ul de la solution violette formazan dans une plaque de microtitration 96 puits à fond plat. Transférer les doublons en fonction de la conception plaque fixe donnée dans le tableur accompagnant ce protocole vidéo. Pour les blancs, utilisez l'isopropanol. </li><li> Lire la densité optique (DO) des extraits de MTT dans un spectrophotomètre plaque de 96 puits en utilisant une longueur d'onde de 570 nm (540-580) sans filtre de référence. </li><li> Inscrivez les résultats dans le tableur pour le calcul automatique des résultats (figure 1). </li><li> Un produit chimique d'essai est étiqueté «irritant» (R38 ou de la catégorie 2 du SGH) si la viabilité du tissu pour cent déterminé par test MTT est &lt;50% par rapport au contrôle négatif. Remarque: Le MTT est toxique, donc n'oubliez pas de porter des gants lorsque vous manipulez. Protéger MTT et sa soilutions de la lumière, puisque MTT est sensible à la lumière. Utiliser une solution de MTT dans quelques heures après sa préparation, car il se dégrade au fil du temps. </li></ol> Qualité Assay V. Contrôles <ul><li> EpiDerm PEV-200-SIT Critères d'acceptation kit: Dans les modèles in vitro RHE devrait fournir des données cohérentes, de haute qualité au fil du temps, pas seulement pendant le processus de validation (8). Lignes directrices recommandées pour assurer la reproductibilité de dosage à long terme et de rendement comprennent «une caractérisation complète des cellules ou des tissus, l'échantillonnage de chaque lot ... pour des performances et l'utilisation régulière des contrôles et des produits chimiques de référence pour fournir une assurance de la cohérence de la performance du test" (9) . En plus de critères d'acceptation de dosage décrites ci-dessous, chaque lot de production de EpiDerm de contrôle de qualité est testé par le fabricant contre un produit chimique de référence supplémentaire (1% de Triton X-100). Le temps d'exposition nécessaires pour réduire la viabilité des tissus à 50% (HE-50) pour le Triton X-100 est déterminée. Pour EpiDerm, moyenne annuelle HE-50 valeurs ont varié de 5,9 à 7,5 heures heures. Le lot de beaucoup CV pour les tissus de contrôle négatif (ie la variabilité de la viabilité de base) a été en moyenne moins de 7,5% pour chaque année depuis 1996. La valeur du ET50 chaque lot de production doit se situer à moins de 2 écarts-types de la moyenne historique Triton X-100 ET50 créé en 1996 (soit HE-50 = 6,7 heures; limite d'acceptation plus faible = 4.8h; limite d'acceptation supérieur = 8.7h) afin d'être libéré pour une utilisation par le fabricant. </li><li> EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 1: Contrôle négatif: L'OD absolue du contrôle négatif (CN) des tissus (traités avec du DPBS stérile) dans le MTT-test est un indicateur de la viabilité des tissus obtenus dans le laboratoire d'essai après l'expédition et le stockage des procédures et des conditions spécifiques d'utilisation. Le test répond au critère d'acceptation si la moyenne des DO 570 des tissus NC est ≥ 1,0 et ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 2: Contrôle positif Une solution à 5% de SDS (en H 2 O) est utilisé comme contrôle positif (CP) et testé concurremment avec les produits chimiques d'essai. Signifie Concurrent que le PC doit être testé dans chaque essai, mais pas plus d'un PC est requis par les tests par jour. Viabilité du contrôle positif doit se situer dans l'intervalle de confiance de 95% des données historiques. Le test répond au critère d'acceptation si la viabilité moyenne des tissus PC exprimée en% des tissus témoins négatifs est de 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 3: déviation standard (SD) Le pouvoir irritant pour la peau est prédite à partir de la viabilité moyenne déterminée sur 3 tissus unique et donc de la variabilité des tissus répétitions doit être suffisamment faible. Le test répond au critère d'acceptation si la SD calculée à partir de différents tissus viabilités% des 3 traités de façon identique répliques est &lt;18%. </li></ul> Les résultats représentatifs <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figure 1"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figure 2"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figure 3"> </div> Figure 1 Les résultats obtenus pour six articles d'essai, NC et de contrôle pour PC -. Une partie de la feuille de calcul automatisé pour le calcul des résultats. Test de produits chimiques qui ont réduit la viabilité des tissus en dessous de 50% référencé à NC sont classés comme irritants. Le test est optimisé pour fournir des résultats qui sont assez loin de la classification de coupure (50% de viabilité) augmentant ainsi la robustesse de l'analyse. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Matériaux </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Liste des matériaux">

<ol><li>Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li>
<li>Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li>
<li>Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Skin+Irritation+Test%3A+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation%3A+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li>
<li>Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).</li>
<li>United Nations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labeling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS)</a>. , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).</li>
<li>ESAC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Statement+on+the+Scientific+Validity+of+In-Vitro+Tests+for+Skin+Irritation+Testing%22">Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing</a>. , ESAC. (2008).</li>
<li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Issues+and+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li>
<li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Current+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs sont employés par la société MatTek, qui produit des réactifs et des outils utilisés dans cet article.

Dans cette vidéo, nous avons démontré le test d&#39;irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) a développé et validé par des tests in vitro d&#39;irritation cutanée des substances chimiques, y compris les ingrédients des produits cosmétiques et pharmaceutiques. Lorsque vous effectuez cette méthode, il est important de travailler dans des conditions aseptiques et de suivre strictement le protocole validé, puisque déviation du protocole peut entraîner des résultats différents. Certaines modifications de l&#39;essai sont possibles, cependant, des modifications au protocole doivent être discutés directement avec les auteurs. La seule limitation de cette méthode est une ingérence possible de la substance d&#39;essai avec le critère de MTT. Une substance d&#39;essai ou d&#39;une couleur qui réduisent directement MTT (et imite ainsi l&#39;activité déshydrogénase des mitochondries cellulaires) peuvent interférer avec le résultat de MTT. Cependant, ces substance d&#39;essai sont un problème seulement si, au moment du test MTT (soit 42 heures après exposition à la substance d&#39;essai) des quantités suffisantes de la substance d&#39;essai sont toujours présents sur (ou dans) les tissus. Dans le cas de cet événement peu probable, la réduction (vrai) MTT métaboliques et de la contribution par un matériel d&#39;essai de couleur ou de (faux) la réduction du MTT directe par le matériel d&#39;essai peut être quantifiée par une procédure décrite en détail dans la procédure de fonctionnement standard de dosage fournie par MatTek Corp

une in vitro test d&#39;irritation cutanée (sit) en utilisant le epiderm humaine reconstruite épidermique (rhe) modèle

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

Le test d&#39;irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) a été développé<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Et validé<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Pour<em&gt; In vitro</emTests&gt; irritation de la peau des substances chimiques, y compris les ingrédients des produits cosmétiques et pharmaceutiques. Le EpiDerm SIT utilise la 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Reconstruite épidermique humain (RHE) EpiDerm modèle. La procédure décrite dans ce protocole permet la discrimination entre les irritants de la catégorie 2 du SGH et non irritants<sup&gt; (6)</sup&gt;. Le test est effectué au cours d&#39;une période de 4 jours, composé de pré-incubation, exposition de 60 minutes, 42 heures post-incubation et de test de viabilité au MTT. Après réception des tissus et nuit pré-incubation (jour 0), les tissus sont localement exposés aux produits chimiques d&#39;essai (jour 1), qui peut être liquide, semi-solides, solides ou de cire. Trois tissus sont utilisés pour chaque produit chimique d&#39;essai, ainsi que pour le contrôle positif (5% aq. Solution SDS), et un contrôle négatif (DPBS). Exposition chimique dure 60 minutes, 35 minutes dont les tissus sont conservés dans une étuve à 37 ° C. Les substances d&#39;essai sont alors retirés de la surface du tissu par une procédure de lavage extensif. Les inserts de tissu sont effacés et transférés dans un milieu frais. Après une période d&#39;incubation de 24 h (jour 2), le milieu est échangé. Le milieu peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie de cytokines ou d&#39;autres paramètres d&#39;intérêt. Après l&#39;échange moyenne, les tissus sont incubés pendant 18 heures supplémentaires. A la fin de l&#39;ensemble de 42h post-incubation (jour 3), les tissus sont transférés dans une solution de MTT jaune et incubées pendant 3 heures. La résultante bleu-violet du sel de formazan, formée principalement par métabolisme mitochondrial, est extrait pendant 2 heures en utilisant l&#39;isopropanol. La densité optique du formazan extraite est déterminé à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. Un produit chimique est classé comme un irritant si la viabilité des tissus par rapport à des tissus traités de contrôle négatif est réduit en dessous de 50%. Cette procédure peut être utilisée en remplacement complet de la peau in vivo chez le lapin test d&#39;irritation pour l&#39;identification des dangers et d&#39;étiquetage des produits chimiques en conformité avec les règlements de l&#39;UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

Dans cette vidéo, nous démontrons le test d&#39;irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) développée et validée pour<em&gt; In vitro</emTests&gt; irritation de la peau des substances chimiques, y compris les ingrédients des produits cosmétiques et pharmaceutiques.

Une In Vitro Test d&#39;irritation cutanée (SIT) en utilisant le EpiDerm humaine reconstruite épidermique (RHE) Modèle

Le test d'irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) a été développé (1,2,3) et validé (4,5) pour l'étude in vitro de l'irritation cutanée provoquée par des produits chimiques, y compris...

Epiderm est un modèle reconstruit in vitro de l'épiderme humain, dérivé de cellules humaines normales, mis au point par la société Matt Tech Corporation. Le protocole de test d'irritation cutanée Epiderm validé par EC VM remplace les tests traditionnels sur animaux pour des produits tels que les cosmétiques, les matières premières et les agents industriels destinés à entrer en contact avec la peau humaine. Ce test débute au jour zéro, lorsque le kit d'irritation cutanée et le tissu Epiderm arrivent au laboratoire, puis sont préconditionnés dans un milieu d'essai après une incubation nocturne.Le premier jour, la surface atypique du tissu épidermique est exposée pendant une heure à un composé irritant putatif, puis l'irritant est éliminé par une étape de lavage le deuxième jour. Après une incubation de 24 heures, l'insert de culture est placé dans un milieu frais et l'ancien milieu peut être utilisé pour l'analyse des cytokines et chimioquines libérées. Le tissu est mis en réaction avec un composé appelé MTT, qui est converti par la réductase mitochondriale en un sel violet foncé formazan.Fournissant une mesure de la viabilité cellulaire. L'absence de couleur violet foncé dans l'échantillon indique une viabilité réduite. Lorsque la mesure colorimétrique d'un composé test est inférieure à 50 % de celle des témoins négatifs, le composé test peut être classé comme irritant.Bonjour, je suis Helena Kava de Matt Corporation. Aujourd'hui, nous allons vous présenter la procédure de test d'irritation cutanée in vitro à l'aide d'un modèle épidermique humain reconstitué, epiderm. Cette procédure peut être utilisée, selon les exigences réglementaires, comme remplacement total ou partiel du test d'irritation cutanée rapide in vivo.Cette nouvelle procédure in vitro peut être utilisée pour l'identification des dangers et l'étiquetage de produits chimiques et de matières premières cosmétiques. Commençons donc. Epiderm est dérivé d'une culture de kératinocytes épidermiques humains afin de former un modèle tridimensionnel, multicouche et hautement différencié de l'épiderme humain.Les tissus sont mitotiquement et métaboliquement actifs, imitant étroitement leurs homologues in vivo tant sur le plan structurel que biochimique, et ce avec une reproductibilité garantie, tout comme l'épiderme humain. Epiderm est composé de couches basales, épineuses et granuleuses organisées ainsi que d'un stratum corné multicouche. Cette dernière couche contient des couches lipidiques lamellaires intercellulaires de Miller disposées selon des motifs analogues à ceux observés in vivo.Ces tissus sont cultivés dans un milieu sans sérum. Chaque tissu est développé dans un insert de culture cellulaire individuel. D'autres configurations sont disponibles, notamment un format à haut débit de 96 puits.La production de tissus prend environ trois semaines pour être complétée. À un stade précis de ce processus, le tissu est élevé à l'interface air-liquide et tout liquide est retiré de la surface APIC du tissu. Les tissus ne sont nourris qu'à travers la surface basolatérale, qui reste en contact avec le milieu de culture propriétaire de Mat Tech. Un kit Epiderm typique contient 24 tissus, chaque tissu ayant un diamètre de neuf millimètres, placés dans leur propre insert de culture tissulaire, ainsi qu'une quantité suffisante de milieu d'essai pour effectuer ce test d'irritation cutanée.Les 24 inserts sont fermement positionnés sur du gel rose AGA imprégné de milieu, un tissu par puits, dans une plaque standard de 24 puits. L'expédition s'effectue par transporteur express à une température de trois à quatre degrés Celsius avant de commencer les essais chimiques. À l'aide du système de test EPIDERM, préparez et stérilisez tous les instruments et outils utilisés dans le dosage conformément à ce qui est décrit dans le protocole écrit. Une partie des matériaux, comme les cotons-tiges, doit être fournie en emballage stérile ou être autoclavée.De l'éthanol à 70 % doit être utilisé pour stériliser les instruments tels que les pinces, et une irradiation UV ou gamma doit être utilisée pour stériliser les bouteilles de lavage. Deux solutions essentielles utilisées dans le test doivent être préparées au préalable : le DPBS et une solution de SDS à 5 %. Dans de l'eau distillée, environ deux litres de DPBS stérile, de pH sept, seront utilisés dans le test, un kit contenant 24 tissus épidermiques.Le DPBS stérile sert de contrôle négatif ainsi que de solution de lavage. Le SDS à 5 % doit être préparé et utilisé comme contrôle positif. Le test d'irritation cutanée commence dès réception du kit EPIDERM EPI 200 SIT.Vérifiez l'intégrité de tous les composants du kit et contactez immédiatement la société Mat Tech en cas de problème ; si tout est présent, passez à l'étape suivante. Pour commencer le test, laissez le milieu d'essai fourni avec le kit atteindre la température ambiante. Ne préchauffez pas dans la hotte à flux laminaire.Préparez une plaque stérile à six puits pour chaque groupe de trois inserts de tissu épidermique et pipetez 0,9 millilitre de milieu d'essai dans chaque puits en conditions stériles. Ouvrez le sachet en plastique contenant la plaque à 24 puits avec les tissus épidermiques sous flux d'air stérile. Retirez le gaz stérile et utilisez des pinces stériles pour extraire soigneusement chaque insert contenant le tissu épidermique.Retirer tout résidu d'aros adhérant aux côtés extérieurs de l'insert en tamponnant délicatement sur de la gaze stérile ou du papier filtre. Ensuite, placer les tissus dans une plaque stérile vide de 24 puits dans les cinq minutes suivantes. Examiner visuellement les inserts.Enregistrez tout défaut du tissu et tout excès d'humidité en surface. N'utilisez pas les tissus défectueux ou les tissus complètement recouverts de liquide.Inserts de tissu optimaux. Doivent présenter une surface sèche et être exempts de détachements, de parties irrégulières ou d'excès de liquide en surface. Ensuite, à l’aide d’un coton-tige stérile, séchez soigneusement la surface des tissus.Évitez de toucher directement le tissu. Les effets capillaires suffisent à éliminer l'humidité de la surface après le séchage. Transférez trois tissus vers la rangée supérieure de chaque groupe de six.Plaque de culture préremplie avec 0,9 millilitre de milieu d'essai. Libérez toutes les bulles d'air piégées sous les inserts. Ensuite, placez les plaques à six puits contenant les inserts dans l'incubateur pendant une heure.Pré-incubation à 37 degrés Celsius. À la fin de la première période de pré-incubation, transférez les inserts des puits supérieurs vers les puits inférieurs de la plaque à six puits. Replacez les plaques dans l'incubateur pour une pré-incubation nocturne.Placer le reste du milieu d'essai dans le réfrigérateur. Après la préincubation nocturne, les produits chimiques d'essai peuvent être appliqués sur les inserts de tissu épidermique. Avant de commencer l'essai d'exposition aux produits chimiques, placer tous les dispositifs, solutions et produits chimiques d'essai nécessaires à température ambiante.Dans la hotte stérile, essuyez tous les flacons de matériel non stérile avec de l'éthanol à 70 % avant de les placer à l'intérieur de la hotte. Le contrôle négatif, le DPBS stérile, le contrôle positif, le SDS à 5 % et l'eau distillée doivent être placés dans la hotte et portés à température ambiante. Un grand flacon doit être mis de côté pour les déchets.Préparez une plaque de six puits pour chaque produit chimique en remplissant uniquement la rangée supérieure avec 0,9 millilitre de milieu d'essai par puits. Étiquetez chaque plaque avec le numéro du tissu et le nom du produit chimique.Environ cinq minutes avant l'exposition prévue aux produits chimiques, retirez les plaques à six puits contenant les tissus préconditionnés de l'incubateur. Évaluez ensuite visuellement la surface des tissus.Éliminer toute humidité à l’aide de cotons-tiges stériles et ne pas appuyer sur la surface du tissu. Enfin, étiqueter les couvercles de la plaque à six puits avec les codes ou les noms des matériaux testés. Ne pas tester plus de six produits chimiques, y compris les contrôles négatif et positif, chacun en triple exemplaire, lors d’un même essai.Utilisez une application chimique et un intervalle de lavage d'une minute pour manipuler les substances témoins connues. Suivez les instructions fournies dans la fiche de données de sécurité ou FDS pour les échantillons codés ou inconnus. Respectez les consignes de sécurité chimique et utilisez une hotte ventilée.Portez des gants et protégez vos yeux et votre visage. Appliquez les produits chimiques sur les tissus à des intervalles d'une minute afin de faciliter le rinçage des produits chimiques d'essai après exposition ; gardez les plaques contenant les tissus traités dans la hotte à flux laminaire jusqu'à ce que le dernier tissu soit traité. Une pipette munie d'une ampoule en bout sera utilisée tout au long de la procédure pour manipuler les tissus et les composés d'essai. Une flamme de bec Bunsen peut être utilisée pour former l'embout en forme de bulbe destiné aux produits chimiques liquides.Distribuez 30 microlitres de l'échantillon liquide à tester directement sur la surface du tissu et déclenchez immédiatement le chronomètre afin qu'il commence à compter. Placez le treillis en nylon à la surface du tissu. Lorsque le chronomètre atteint une minute, ajoutez le second composé liquide. Utilisez trois tissus par produit chimique testé, en veillant à ajouter chaque composé à des intervalles d'une minute.Pour tester les produits semi-solides, utilisez une pipette à déplacement positif pour distribuer 30 microlitres directement sur le tissu. Si nécessaire, étalez le produit chimique à l’aide d’une pipette Pasteur afin d’obtenir une surface équivalente à celle du tissu. Peu de temps avant l’application de la substance solide, humidifiez la surface du tissu avec 25 microlitres de DPBS stérile afin d’améliorer le contact entre la surface du tissu et le produit chimique à tester ; remplissez ensuite une cuillère à application pointue de 25 milligrammes avec le matériau finement broyé.Appliquez la substance d'essai solide sur la surface du tissu. Si nécessaire, utilisez une poire stérile fixée à votre pipette pour vider complètement la cuillère. Secouez doucement les inserts pour favoriser la répartition du solide à la surface.Vous pouvez également utiliser l'embout sphérique de votre pipette pour ajuster le volume au diamètre du tissu. N'appuyez pas sur la surface du tissu. Enfin, appliquez le DPBS comme contrôle négatif et le SDS à 5 % comme contrôle positif sur les inserts de tissu, également en triplicat, après administration sur le dernier tissu, puis transférez toutes les plaques dans l'incubateur humide à 37 degrés Celsius pendant 35 minutes, plus ou moins une minute.Pendant cette incubation, veillez à placer tous les matériaux nécessaires aux étapes de lavage dans la hotte. À l’issue de l’incubation de 35 minutes, retirez toutes les plaques de l’incubateur. Placez-les dans la hotte stérile et attendez une période de 60 minutes afin que l’exposition chimique soit terminée pour les tissus traités à la première dose.Ensuite, commencez la procédure de lavage. Rincez les tissus avec du DPBS stérile 15 fois. Pour éliminer tout résidu de produit test, remplissez l'insert de tissu à l'aide d'un flux constant de DPBS fourni à 1,5 centimètre du tissu et videz-le.Veillez à ce que le flux de DPBS ne soit pas trop fa faible, sans quoi la substance d'essai ne sera pas éliminée. Respectez un intervalle d'une minute pour laver quatre tissus avec un tamis en nylon, effectuez cinq lavages et retirez soigneusement le tamis à l’aide de pinces fines et pointues. Puis poursuivez avec les 10 lavages restants après le 15e, rincez en immergeant complètement l'insert dans un flacon de lavage, effectuez trois rinçages avec 150 millilitres de DPBS et agitez afin d'éliminer le résidu de la substance d'essai.Enfin, rincez le tissu. Insérez une fois par l'intérieur et une fois par l'extérieur avec du DPBS stérile. Éliminez tout excès de DPBS du tissu en secouant doucement l'insert et en l'essuyant sur du papier absorbant stérile.Ensuite, transférez les inserts de tissu transférés sur membrane vers la nouvelle plaque de six puits préalablement remplie de milieu d'essai. Rappelez-vous encore une fois que toutes ces étapes doivent être effectuées dans l'intervalle d'une minute afin de maintenir une durée d'exposition de 60 minutes pour chaque échantillon exposé. Après le rinçage du dernier tissu, séchez soigneusement la surface de chaque tissu à l’aide d’un applicateur stérile à embout cotonneux.Si des traces de la substance chimique sont encore présentes sur la surface, essayez de les éliminer à l’aide du coton-tige stérile. Incubez enfin les tissus dans l’incubateur pendant les 24 heures suivantes. Notez l’heure de début de l’incubation sur la feuille de documentation des méthodes.Enregistrez également toutes les différentes applications sur la fiche de documentation de la méthode. Joignez à la procédure opératoire normalisée fournie par Mat Tech Corporation le déplacement des plaques dans la hotte. Transférez l'insert dans la partie inférieure de la plaque à six puits préremplie avec 0,9 millilitre de milieu.Prélèver le milieu de la rangée supérieure et le transférer dans une plaque 24 puits préalablement étiquetée, puis placer la plaque à moins 20 degrés Celsius. L'analyse des cytokines et/ou chimiotactines libérées dans le milieu de culture est une étape facultative avant l'analyse. Poursuivre l'incubation pendant encore 18 heures, plus ou moins trois heures, pour le test MTT. Étiqueter 2 plaques 24 puits avec les noms chimiques ou les codes.Veillez à porter des gants de protection, car le MTT est toxique lors de la manipulation. Préparez la solution de MTT en décongelant le concentré de MTT et en le diluant avec le diluant de MTT.Protéger de la lumière car le MTT est sensible à la lumière et l'utiliser dans les deux à trois heures suivant sa préparation. Comme le MTT se dégrade au fil du temps, pipeter 300 microlitres de milieu contenant le MTT dans chaque puits de la plaque 24 puits. Retirer maintenant les plaques 6 puits de l'incubateur.Épongez le fond des inserts sur du papier buvard et transférez-les dans la plaque 24 puits préremplie de MTT. Placez la plaque 24 puits dans l'incubateur et incubez pendant trois heures. N'oubliez pas d'enregistrer l'heure de début de l'incubation au MTT dans le DMS ; respectez strictement la durée d'incubation de trois heures afin d'éviter d'obtenir des mesures de MTT variables. Une fois l'incubation au MTT terminée, utilisez une pompe à aspiration équipée d'un piège à déchets toxiques pour aspirer délicatement le milieu de MTT de tous les puits.Remplissez à nouveau les puits avec du DPBS et aspirez. Répétez ce rinçage deux fois supplémentaires et assurez-vous que les tissus sont secs après la dernière aspiration. Après les lavages, transférez les inserts dans une nouvelle plaque de 24 puits et immergez-les en pipetant doucement deux millilitres de solution d'extrait dans chaque insert.Le niveau montera au-dessus des bords supérieurs de l'insert, recouvrant ainsi complètement les tissus des deux côtés. Scellez la plaque 24 puits à l’aide d’un scelleur thermique ou de paraform pour empêcher l’extraction et l’évaporation. Notez l’heure de début de l’extraction sur la fiche de documentation des méthodes et effectuez l’extraction pendant au moins deux heures à température ambiante avec un agitation douce sur un agitateur de plaque. Une fois la période d’extraction terminée, percez les inserts à l’aide d’une aiguille d’injection ou d’une pipette à embout caoutchouc et laissez l’extrait s’écouler dans le puits d’où l’insert a été prélevé.Jetez les inserts perforés et pipetez la solution dans le puits trois fois vers le haut et vers le bas jusqu'à ce qu'elle soit homogène. Un agitateur de plaque réglé à 120 tr/min peut également être utilisé pour chaque tissu. Transférez deux aliquots de 200 microlitres de la solution au formazan bleu dans une microplaque de 96 puits à fond plat.Transférez les duplicatas selon le schéma fixe de la plaque indiqué dans le tableau accompagnant ce protocole vidéo pour les témoins. Utilisez de l'isopropanol, mesurez la densité optique (DO) à l’aide d’un spectrophotomètre pour plaque de 96 puits, à une longueur d’onde de 570 nanomètres, sans filtre de référence. Saisissez les résultats dans le tableau pour un calcul automatique des résultats.Prendre en compte les corrections dues aux interférences du produit chimique testé comme indiqué dans le protocole accompagnant ; un produit chimique testé est classé comme irritant. Si le pourcentage de viabilité tissulaire est inférieur ou égal à 50 % après analyse spectro-photométrique, que l'OD à 570 nm des tissus du contrôle négatif (NC) est supérieure ou égale à 1 et inférieure ou égale à 2,5, que la viabilité moyenne des tissus du contrôle positif (PC), exprimée en pourcentage par rapport aux tissus du contrôle négatif, est inférieure à 20 %, et que l'écart-type (SD) calculé à partir des viabilités tissulaires individuelles exprimées en pourcentage pour trois réplicats identiquement traités est inférieur à 18 %, alors les composés dont les valeurs de viabilité cellulaire sont inférieures à 50 % peuvent être considérés comme des irritants.Nous venons de vous montrer comment réaliser le test validé d'irritation cutanée de 60 minutes et 42 heures à l'aide du modèle de peau humaine reconstituée Epiderm. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler qu'une grande partie du test est effectuée en conditions stériles ou aussi aseptiques que possible. Si vous devez modifier la méthode ou si vous avez besoin d'une explication plus détaillée concernant une des étapes de la procédure, n'hésitez pas à nous contacter pour obtenir de l'aide et des conseils.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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