Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiology
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Commençons par une larve de poisson-zèbre euthanasiée avec un intestin infecté par Clostridioides difficile, une bactérie anaérobie pathogène.
Fixez la partie supérieure du tronc dorsal de la larve et retirez sa tête pour exposer les organes internes.
Fixez le tronc médio-dorsal et isolez doucement l’intestin de la cavité corporelle.
Transférez l’intestin isolé dans un tube de microcentrifugation contenant un tampon.
Homogénéiser l’intestin à l’aide d’un pilon pour perturber les tissus et libérer les microbes intestinaux.
Transvasez l’homogénat dans un tube contenant des milieux d’élevage sélectifs complétés par des antibiotiques.
Incuber l’homogénat dans une chambre anaérobie.
Les conditions anaérobies inhibent la croissance des bactéries aérobies, tandis que les antibiotiques ciblent et suppriment spécifiquement la croissance des microbes intestinaux anaérobies natifs.
Clostridioides difficile résiste à ces antibiotiques et prolifère dans des conditions anaérobies.
Les nutriments et les facteurs de croissance dans le milieu d’élevage favorisent davantage la division cellulaire, permettant la croissance de Clostridioides difficile viables.
Après avoir euthanasié les larves de poisson-zèbre infectées, insérez une aiguille dans le tronc dorsal des larves de poisson-zèbre près de la tête pour immobiliser le poisson-zèbre. Retirez la tête derrière les branchies avec une lancette.
Insérez une deuxième aiguille au milieu du tronc dorsal. Insérez une troisième aiguille dans l’abdomen du poisson-zèbre et retirez l’intestin de la cavité corporelle. À l’aide d’une aiguille de micro-injection, transvaser 10 à 15 intestins dans un tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de PBS 1X stérile.
Homogénéisez les intestins à l’aide d’un pilon pour perturber les tissus et préparez des homogénats. Assurez-vous que le pilon atteint le fond du tube pour perturber complètement tous les intestins. Dans les homogénats, ajouter le milieu d’élevage de Clostridioides difficile contenant de la D-cyclosérine et de la céfoxitine, avec ou sans taurocholate, et incuber dans une chambre anaérobie.