Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiology
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Commencez par une culture d’E. coli isolée chez des nouveau-nés atteints d’infections sanguines.
Centrifugez pour granuler les bactéries, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu sans antibiotique.
Prenez une plaque avec un insert transwell contenant une monocouche de cellules épithéliales intestinales.
Mesurez la résistance électrique à travers la couche cellulaire à l’aide d’une sonde pour confirmer l’intégrité de la monocouche.
Ajoutez la suspension bactérienne dans l’insert et incubez.
Les bactéries adhèrent aux cellules épithéliales, sont internalisées dans les vésicules et sont transportées à travers les cellules jusqu’au puits inférieur via un processus appelé transcytose.
Mesurez à nouveau la résistance électrique ; Une valeur stable confirme une monocouche intacte lors de la transcytose.
Transférez l’insert dans un puits frais et récupérez le milieu du puits inférieur précédent.
Placez le milieu collecté sur une plaque de gélose et incubez pour développer les colonies bactériennes.
Comptez les colonies pour déterminer l’étendue de la transcytose d’E. coli à travers la barrière épithéliale intestinale.
Toutes les 30 minutes après l’inoculation, remplissez les nouveaux puits avec 500 microlitres de MTC sans antibiotiques, et transférez les inserts dans ces nouveaux puits. Récupérez le support du puits de collecte usagé pour chaque insert dans un tube étiqueté séparé et placez le tube sur de la glace. Remettez la plaque Transwell dans l’incubateur entre les points temporels.
Pour chaque insert, combinez les médias collectés à différents points temporels et vortex brièvement. Plaquez le milieu collecté sur des plaques de tarière LB en utilisant la méthode de dilution sur piste pour quantifier le nombre de bactéries transcytoses au cours des deux premières heures de l’expérience. Récupérez les médias à quatre et six heures.
De plus, au bout de six heures, plaquez le média à partir des puits de contrôle. Au bout de six heures, mesurez et enregistrez le FEER. Après une nuit d’incubation, comptez les colonies bactériennes manuellement sur les plaques LB de dilution de la piste.