Absorption de l’ADN induite par la compétence chez Staphylococcus aureus

Prenez une culture de S. aureus sensible à l’antibiotique chloramphénicol.

Centrifuger pour granuler les bactéries et éliminer le surnageant.

Transférez la pastille dans un tube contenant un milieu limitant les nutriments et incuber. Le stress nutritionnel améliore la compétence de la bactérie à internaliser l’ADN étranger.

Centrifugez à nouveau et retirez le surnageant. Remettre le granulé en suspension dans un milieu frais limitant les nutriments.

Ensuite, ajoutez de l’ADN extrait d’une souche de S. aureus portant un gène résistant au chloramphénicol. Couver.

La machinerie d’absorption de l’ADN traite l’ADN en un seul brin et le transfère dans le cytoplasme, où il s’intègre dans le chromosome bactérien.

Centrifugez et retirez le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans un milieu riche en nutriments.

Transférez la suspension dans une gélose fondue riche en nutriments contenant du chloramphénicol.

Versez le mélange dans un plat et incubez.

La croissance de colonies résistantes au chloramphénicol indique une absorption réussie de l’ADN.

Cultivez la cellule réceptrice pendant la nuit, dans cinq millilitres de TSB à 37 degrés Celsius en agitant. Le lendemain matin, transférez 0,5 millilitre de la culture de nuit dans un tube de 1,5 millilitre.

Précipiter les cellules par centrifugation. Ensuite, suspendez les cellules avec 10 millilitres de milieu CS2 dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, faites pousser les bactéries à 37 degrés Celsius avec des secousses à 180 rotations par minute pendant huit heures jusqu’à la fin de la phase exponentielle.

Récoltez les cellules par centrifugation. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu CS2 frais. Ajoutez 10 microgrammes de plasmide purifié ou d’ADN génomique à la suspension cellulaire.

Secouez la culture à 180 rotations par minute. Récupérez ensuite les cellules par centrifugation. Remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu BHI.

Mélangez la suspension cellulaire avec 90 millilitres de supplément de gélose BHI fondu Avec 32 milligrammes par litre de chloramphénicol et cinq microgrammes par litre de tétracycline dans l’expérience de contrôle. Versez le mélange dans les boîtes de Pétri de 90 millimètres et laissez refroidir rapidement et laisser la gélose se solidifier. Répliquer les colonies à l’aide de cure-dents dans des assiettes contenant des antibiotiques appropriés pour confirmer leurs caractéristiques de résistance.