Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiology
0 vues • 2:51 min • October 30th, 2025
Commençons par une souche non typable d’Haemophilus influenzae , un agent pathogène des voies respiratoires humaines.
Étalez la culture bactérienne sur un milieu sélectif riche en nutriments et incubez-la dans des conditions enrichies en CO2 pour imiter l’environnement des voies respiratoires.
Pendant l’incubation, les bactéries utilisent les nutriments et se multiplient, formant des colonies.
Transférez une colonie dans un milieu liquide sélectif et incubez pour favoriser la croissance bactérienne en culture liquide.
Transvaser une aliquote dans un tube de microcentrifugation.
Centrifugeuse pour séparer les bactéries et jeter le surnageant.
Remettez les bactéries en suspension dans un tampon, centrifugez-les à nouveau pour les laver et les séparer, puis jetez le surnageant résiduel contenant du milieu.
Remettez les bactéries en suspension dans le tampon et diluez-les.
À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la densité optique à 600 nm pour estimer la concentration bactérienne.
Déposer la culture bactérienne diluée sur un milieu sélectif et incuber pour former des colonies.
Comptez les colonies pour calculer les unités formant des colonies pour préparer l’inoculum pour une utilisation future.
Déposer le NTHI sur une plaque de gélose au chocolat. Incuber l’assiette à l’envers pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, cultivez les bactéries dans un bouillon d’infusion cerveau-cœur.
Ensuite, dans un tube de microcentrifugation, ajoutez un millilitre de bouillon. Faites tourner le mélange à 4 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS. Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
Ensuite, diluez 100 microlitres de solution remise en suspension dans 900 microlitres de PBS et mesurez l’absorbance de la culture à 600 nanomètres. Utilisez cette information pour ajuster l’inoculum à 20 millions d’UFC par millilitre.
Ensuite, déterminez la viabilité et les UFC de l’inoculum. Cultivez une à dix dilutions en série du bouillon sur des plaques de gélose au chocolat et incubez les plaques pendant la nuit.