Expression de protéines acellulaires à l’aide d’un extrait de cellules brutes bactériennes

Un système d’expression de protéines acellulaires utilise un lysat de cellules brutes bactériennes, qui contient la machinerie moléculaire essentielle à la transcription et à la traduction in vitro.

Ce lysat comprend des facteurs de transcription, des ribosomes et des ARN de transfert (ARNt).

Ajoutez au lysat un mélange contenant une matrice d’ADN, l’ARN polymérase, des nucléotides et des acides aminés.

Transférez-le sur une plaque PCR et centrifugez-le pour recueillir le liquide collé aux parois. Scellez la plaque pour éviter l’évaporation.

Incuber dans un thermocycleur à une température optimale pour favoriser l’expression des protéines acellulaires.

Le facteur de transcription s’associe à l’ARN polymérase pour former un complexe qui se lie à l’ADN matrice.

Ce complexe catalyse la synthèse de l’ARN, incorporant des nucléotides pour générer un ARN messager (ARNm).

L’ARNm recrute des ribosomes, qui initient la traduction, au cours de laquelle les ARNt délivrent les acides aminés correspondants pour former une chaîne polypeptidique.

Le polypeptide se replie en une protéine fonctionnelle, prête pour les applications en aval.

Pour effectuer l’expression de protéines acellulaires à l’aide d’un master mix de solution énergétique 10X de décongélation, d’aliquotes de master mix d’acides aminés 4X et d’un modèle d’ADN à température ambiante. Retirez ensuite les stocks d’ARN polymérase T7 et d’inhibiteur d’ARNASE du congélateur à moins 20 degrés Celsius et placez-les sur de la glace. Une fois que la matrice d’ADN, le mélange maître de solution énergétique 10X et le mélange maître d’acides aminés 4X sont décongelés, placez-les sur de la glace.

Préparez un mélange maître de réaction sans cellule en ajoutant chaque composant dans l’ordre précis dans un tube de deux millilitres sur de la glace, et agitez doucement le tube après chaque ajout au mélange principal. Retirez le lysat de cellules brutes Vibrio natriegens du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-le sur de la glace pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce qu’il soit décongelé. Ajoutez le volume approprié d’extrait de cellule brute décongelé au mélange maître de réaction acellulaire et mélangez délicatement à l’aide d’une pipette.

Pour effectuer l’expression finale de protéines acellulaires à l’aide d’un thermocycleur, ajoutez d’abord 10 microlitres du mélange maître de réaction acellulaire par puits du fond d’une plaque PCR à 96 puits, en veillant à mélanger le mélange principal en faisant glisser doucement le tube entre chaque transfert sur la plaque PCR. Centrifugez la plaque à 1 000 fois g pendant 10 secondes pour regrouper tout mélange maître qui aurait pu être collé sur les côtés des puits. Ensuite, scellez les puits avec un adhésif pour plaque pour éviter l’évaporation.

Placez la plaque dans un thermocycleur réglé à 26 degrés Celsius avec un couvercle chauffant réglé à 105 degrés Celsius. Après avoir incubé les réactions dans la plaque PCR pendant au moins trois heures, les protéines exprimées peuvent être purifiées, quantifiées et utilisées pour les processus en aval.