Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiology
0 vues • 3:09 min • November 28th, 2025
Prenons une culture génétiquement modifiée d’E. coli exprimant un réseau opérateur de tétracycline chromosomique (tetO).
Les bactéries portent également un plasmide doté d’un promoteur induisible par l’arabinose qui favorise l’expression de la protéine répressrice tétracycline marquée YFP.
Transférez la culture dans un milieu nutritif enrichi contenant des antibiotiques, puis incubez en secouant pour sélectionner des cellules contenant des plasmides.
À mesure que les cellules grandissent, les réresponsomes se forment et initient la réplication de l’ADN chromosomique.
À la phase exponentielle, on collecte une portion comme contrôle non induit.
Ajoutez l’arabinose, un inducteur, à la culture restante et incubez les deux cultures en secouant.
Dans la culture non induite, le dimère AraC reste lié à la boucle d’ADN, inhibant l’expression du répresseur.
Dans la culture induite, l’arabinose se lie au dimère AraC, induisant une expression répressive.
Les protéines répresseurs se lient à l’ensemble chromosomique tetO, stoppant la progression de la fourche de réplication.
Utilisez la microscopie à fluorescence pour observer les deux cultures.
Les foyers fluorescents dans la culture d’E. coli induite confirment un blocage de la réplication médié par la protéine répressive.
Une souche d’E. coli transportant un réseau opérateur de tétracycline dans le plasmide pKM1 est utilisée pour cette procédure. pKM1 code pour TetR-YFP, une protéine répressrice tétracycline inductible et fluorescente jaune.
Diluez une culture fraîche et révélée de cette souche d’E. coli jusqu’à une densité optique de 600 nanomètres de 0,01 dans un milieu complexe dilué avec des antibiotiques nécessaires pour la sélection. Faire pousser la culture à 30 degrés Celsius en le secouant jusqu’à une densité optique de 600 nanomètres de 0,05 à 0,1. Prélève un échantillon de 10 millilitres pour servir de témoin non induit.
Ajouter 0,01 % d’arabinose à la culture restante pour induire la production de TetR-YFP à partir de pKM1. Continuez à faire croître à la fois les cultures non induite et induite à 30 degrés Celsius avec des secousses. Après une heure, vérifiez la présence d’un point focal unique dans chaque cellule de la culture induite à l’aide de la microscopie à fluorescence.
Si les cellules induites sont confirmées comme obstruées, ce qui est indiqué par plus de 70 % des cellules ayant un seul foyer, enregistrez la densité optique et retirez 7,5 millilitres de l’échantillon pour analyse par électrophorèse en gel bidimensionnelle. Retirer un échantillon équivalent de la culture témoin non induite.