Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiology
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Prélèvez un échantillon d’eau de mer contenant divers microbes, y compris des bactéries dégradant les polluants environnementaux.
Diluez en série l’échantillon pour réduire la densité microbienne et placez-le sur un milieu nutritif.
Après l’incubation, sélectionnez des colonies morphologiquement distinctes, qui peuvent encore abriter des types bactériens génétiquement et métaboliquement diversifiés.
Striez chaque colonie sélectionnée pour disperser les cellules individuelles et les incuber.
Chaque cellule forme une colonie, représentant un isolat bactérien génétiquement pur avec un profil métabolique distinct.
Inoculez chaque isolat dans un milieu de croissance et incubez pour augmenter la biomasse.
Centrifugez la culture, jetez le surnageant et lavez avec un tampon pour éliminer le milieu résiduel.
Resuspendez les cellules dans le tampon et inoculez-les dans un milieu de sélection contenant EE2, un polluant environnemental.
En tant que seule source de carbone dans le milieu, EE2 sélectionne des bactéries capables de le métaboliser pour produire de l’énergie et de la croissance.
La turbidité dans le milieu indique une croissance bactérienne, confirmant l’isolement de l’isolat bactérien dégradant les polluants.
Pour sélectionner les bactéries, il faut d’abord effectuer des dilutions en série jusqu’à 10 à la négative neuf dans une solution saline stérile pour les échantillons de corail et jusqu’à 10 à la négative six pour les échantillons d’eau. La pipette dilue cinq fois avant de jeter la pointe.
Ensuite, fais un vortex sur chacun. Faites passer les échantillons pendant cinq secondes à chaque fois avant d’effectuer la prochaine dilution en série. Pipettez 100 microlitres de chaque dilution sur des boîtes de Petri contenant 3 % de chlorure de sodium pour le bouillon de lysogenèse et agar et placez-les dans les assiettes.
Incubez les plaques pendant un à trois jours à la température cible, par exemple 26 degrés Celsius. Vérifiez les plaques une fois par jour. Sélectionnez et isolez les colonies présentant des morphologies de croissance distinctes sur de nouvelles plaques en utilisant la technique de la plaque striée.
Répétez cette étape autant de fois que nécessaire pour que des colonies pures poussent sur les plaques. Conservez les isolats à quatre degrés Celsius ou dans du glycérol comme décrit dans le manuscrit. Pour effectuer le test de capacité de dégradation EE2, il faut prélever une colonie unique parmi les plaques fraîches et ininoculer dans deux millilitres de milieu LB stérile dans un tube.
S’il s’agit d’une bouillie de glycérol, prenez 10 microlitres de bouillon bactérien de glycérol et faites-le passer sur des plaques d’agar LB. Incubez à 24 à 28 degrés Celsius toute la nuit pour que des colonies individuelles se développent. Placez le tube contenant le milieu LB incliné sous agitation constante à 150 fois g à 24 à 28 degrés Celsius pendant la nuit.
Après la croissance bactérienne, pelletez les cellules en les centrifugant à 8 000 g pendant huit minutes à température ambiante. Jetez le surnageant. Pour laver le bouillon LB restant, ajoutez deux millilitres d’eau salée pour remettre les cellules en suspension.
Répétez le lavage deux fois pour vous assurer qu’il n’y a aucune trace de carbone. Inoculez les cellules lavées et en suspension dans un milieu de culture Bushnell Haas minimal contenant de l’EE2 comme seule source de carbone. Évaluez la croissance bactérienne par densité optique à 600 nanomètres et notre colonie formant des unités sur un milieu agar LB après 16 à 72 heures d’incubation.