Coloration de Giemsa pour le test de formation de colonies : une procédure de coloration in vitro pour évaluer la capacité de prolifération des cellules souches mésenchymateuses

Les tests de formation de colonies mesurent la capacité proliférative des cellules à se développer en colonies.

Tout d’abord, une suspension cellulaire dérivée de la moelle osseuse comprenant des érythrocytes et des cellules mononucléaires, y compris des cellules souches mésenchymateuses ou CSM, dans des milieux sur une plaque de culture et incubée. Les CSM adhèrent au fond de la plaque tandis que les érythrocytes et les cellules mononucléées restent en suspension et sont jetés.

Ajouter des milieux frais contenant des facteurs de croissance pour favoriser la survie des CSM. En fonction de leur potentiel prolifératif individuel, les CSM se répliquent pour former des colonies.

Ensuite, traitez les colonies avec du méthanol. Le méthanol perméabilise les cellules, déplace l’eau de l’environnement intracellulaire et dénature les protéines, préservant ainsi l’architecture cellulaire.

Incuber les colonies fixées avec une solution de coloration Giemsa - un mélange de produits d’oxydation du bleu de méthylène, principalement de l’azur B, un colorant basique, et de l’éosine Y, un colorant acide. Lors de la diffusion dans les cellules, les dimères B azur chargés positivement se lient par intercalation à l’ADN chargé négativement dans le noyau, conférant une coloration bleue.

Les monomères Y de l’éosine chargés négativement interagissent ensuite avec des charges positives non neutralisées sur des dimères B azur liés, formant un « complexe éosine-Y-azure-B », changeant la coloration de l’ADN coloré en violet.

Dans le cytoplasme riche en ribosomes, l’azur B se lie à l’ARN chargé négativement, mais la pénétration réduite de l’éosine Y dans les ribosomes très denses empêche la formation du complexe éosine-Y-azure-B, colorant l’ARN en bleu.

Maintenant, lavez la plaque avec un tampon pour enlever l’excès de tache et séchez-la à l’air. Comptez le nombre de colonies, qui apparaissent comme des amas de cellules avec des noyaux violets et un cytoplasme bleu.

Pour effectuer le dosage de l’UFC, préparer 10 millilitres de solution de Giemsa par plat, en diluant la solution mère 1 à 10 avec de l’eau stérile. Retirez le milieu de la boîte de culture cellulaire et utilisez du PBS pour laver soigneusement les cellules.

Avec du méthanol pur, fixez les cellules à température ambiante pendant 5 minutes, puis jetez le méthanol et ajoutez la solution Giemsa. Incuber dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les cellules deux fois. Ensuite, faites sécher l’assiette à l’air libre la tête la première sur une serviette en papier. À l’aide d’un marqueur au dos de la plaque, comptez manuellement les colonies.