Encyclopédie des expériences JoVE
Biological Techniques
0 vues • 2:59 min • July 8th, 2025
Pour la séparation par chromatographie d’échange d’anions d’une protéine d’intérêt d’un lysat de protéine bactérienne dialysée, ajoutez un tampon de liaison pour réduire la viscosité du lysat et l’empêcher d’obstruer la colonne chromatographique.
Les agents chélateurs contenus dans le tampon se lient aux cations divalents, inhibant l’activité de la protéase et empêchant la dégradation des protéines. De plus, le tampon avec un pH supérieur au point isoélectrique de la protéine cible, pI, le pH auquel la protéine n’a pas de charge nette, fait que les ions hydroxyles chargés négativement en excès neutralisent les groupes amines chargés positivement de la protéine, rendant la surface de la protéine chargée négativement.
Assemblez la colonne de chromatographie échangeuse d’anions contenant une phase stationnaire réticulée à base d’agarose avec des groupes amines quaternaires chargés positivement. Ajoutez le tampon de liaison pour préparer la colonne à une interaction maximale avec les protéines pendant le chargement de l’échantillon. Chargez le lysat bactérien dilué.
Les protéines cibles chargées négativement se lient plus étroitement aux groupes chargés positivement dans la colonne que les protéines moins chargées négativement.
Exécutez le tampon de liaison pour éliminer les protéines chargées positivement non liées de la colonne. Faites passer un tampon d’élution à travers la colonne, en augmentant progressivement la concentration en sel. À de faibles concentrations de sel, les ions négatifs entrent en compétition avec les protéines faiblement liées pour se lier à la colonne, provoquant leur élution.
Par la suite, le tampon à haute concentration en sel déplace les protéines d’intérêt étroitement liées avec un temps de rétention plus long, éluant les protéines cibles. Les protéines cibles collectées peuvent être utilisées pour une analyse plus approfondie.
Démarrez le FPLC avec l’entretien général. Connectez les tampons de colonne AIEX-A et AIEX-B aux vannes tampons, et la colonne contenant de la résine échangeuse d’anions aux orifices de colonne du FPLC. Ajustez les paramètres chromatographiques généraux en conséquence.
Démarrez le programme AIEX dans le logiciel FPLC et choisissez le volume d’équilibrage pour le tampon A. Ensuite, chargez l’échantillon sur la colonne et éluez les protéines avec un gradient linéaire de 0 % à 100 % de tampon à haute teneur en sel. Prélever des fractions de 2 millilitres pendant l’élution.
Analysez les fractions éluées après avoir terminé le cycle.