Une méthode in vitro pour générer des organoïdes cérébraux humains

Commençons par une culture de neurosphères, des amas flottant librement de cellules progénitrices neuroépithéliales.

Transférez ces neurosphères sur une feuille d’encastrement.

Retirez le support. Ajoutez une goutte de matrice membranaire extracellulaire contenant des protéines et des facteurs de croissance à chaque neurosphère.

Incuber pour que la matrice se solidifie, en intégrant les neurosphères en son sein.

Maintenant, transférez les neurosphères intégrées dans la matrice à l’aide de milieux neurosphériques vers une plaque de culture contenant des milieux neurosphériques.

couver. La matrice membranaire extracellulaire et ses constituants facilitent la différenciation des cellules progénitrices neuroépithéliales en cellules neuroépithéliales qui prolifèrent et forment des lumières remplies de liquide.

Après l’incubation, transférez les neurosphères dans une fiole tournante contenant des organoïdes cérébraux préchauffés. Incuber avec agitation pour une meilleure diffusion de l’oxygène et des nutriments, favorisant la croissance cellulaire.

Les facteurs de croissance et les inhibiteurs de petites molécules dans les milieux favorisent la différenciation neuronale et se développent en cellules de régions cérébrales spécifiques, formant des organoïdes cérébraux matures.

Pour commencer cette procédure, collectez les neurosphères à l’aide d’une micropipette de 200 microlitres, à l’aide d’une pointe de 2 millimètres préalablement coupée avec des ciseaux stériles. Ensuite, placez les neurosphères à environ 5 millimètres les unes des autres sur un film de paraffine dans une parabole de 100 millimètres, et retirez soigneusement autant de milieu restant que possible. Ensuite, ajoutez une goutte de matrice EHS sur chaque neurosphère.

Incuber les gouttes de matrice EHS avec les neurosphères pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après cela, lavez soigneusement les neurosphères du film de paraffine en les rinçant avec un milieu neurosphérique. Par la suite, incubez les neurosphères pendant les quatre prochains jours et ajoutez 2 millilitres de milieu neurosphérique frais le deuxième jour.

Dans cette procédure, ajoutez 100 millilitres de milieu organoïde cérébral dans chaque fiole tournante à travers ses bras latéraux et préchauffez le milieu dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Ensuite, assurez-vous que les neurosphères sont toutes séparées. Si deux ou plusieurs sont reliés par une matrice EHS, séparez-les en coupant la matrice de connexion avec un scalpel.

Mettez en place un programme d’agitation à 25 RPM. Transférez soigneusement les neurosphères intégrées à la matrice EHS dans les flacons tournants contenant 100 millilitres de milieu organoïde. Ensuite, placez les flacons tournants sur une plate-forme d’agitation magnétique dans l’incubateur pendant 14 jours à 37 degrés Celsius. C’est le jour zéro de la culture d’organoïdes. Changez le milieu une fois par semaine en retirant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais.