Technique d’incubation prolongée du tissu neuronal de la rétine

Prenez un œil de souris intact dans du liquide céphalo-rachidien artificiel, ou aCSF, et incisez pour isoler l’œilleton contenant la rétine.

Traiter avec une solution enzymatique pour éliminer la membrane limitante interne, exposant les cellules neuronales.

Plongez le tissu dans une solution d’inhibition pour arrêter la digestion et lavez-le pour éliminer l’excès de solution.

Placez le tissu dans un incubateur spécialisé à basse température pour ralentir le métabolisme cellulaire, préservant ainsi le tissu.

Cet incubateur se compose d’une chambre principale avec un grillage pour le montage des tissus. La chambre est remplie d’aCSF, et sa température et son pH sont contrôlés pour préserver la fonctionnalité des tissus.

Pour éliminer la contamination microbienne, l’aCSF est pompé dans une autre chambre et traité avec un rayonnement ultraviolet pour tuer tous les microbes.

L’aCSF stérilisé est ensuite pompé dans la chambre principale.

Pour isoler la rétine, retirez l’œilleton, séparez la rétine des tissus environnants et remettez-la dans l’incubateur.

Pour la préparation du montage rétinien entier, énucléer immédiatement les yeux d’un animal euthanasié. Faites une petite incision le long de l’ora serrata et placez les yeux dans Ames Media ou aCSF avec un apport en carbogène à température ambiante. Après cela, retirez immédiatement la cornée, le cristallin et le vitré en coupant le long de l’ora serrata avec de petits ciseaux, et retirez-les avec des pinces. Placez le tissu dans le système d’incubation à température ambiante.

Pour retirer la membrane limitante interne, transférez l’œilleton contenant la rétine dans un petit bocal en verre contenant de la papaïne, de la L-cystéine, de l’EDTA et de la DNAse à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Appliquez du carbogène à la solution à travers le couvercle, mais ne faites pas de bulles. Arrêtez la digestion enzymatique en plaçant le tissu dans une solution d’ovomucoïde et de BSA pendant 10 minutes dans du BSS d’Earl’s. Ensuite, lavez soigneusement le tissu avec un LCR.

Par la suite, transférez le tissu dans le système d’incubation et réduisez la température à environ 15 à 16 degrés Celsius. Ensuite, transférez le tissu rétinien au microscope ; Isolez la rétine de l’œilleton et coupez-la en quatre morceaux avec une lame de rasoir. Si toute la rétine est nécessaire, faites quatre petites incisions à la périphérie de la rétine pour lui permettre de rester à plat.

Ce tissu peut maintenant être transféré au microscope pour l’électrophysiologie, ou maintenu dans le Braincubator. Le tissu est maintenu dans la chambre principale contenant les sondes pour les mesures de pH et de température. Une deuxième chambre est isolée de la chambre principale et est exposée à une lumière UVC de 1,1 watt afin d’irradier les bactéries flottant dans la solution. Utilisez une pompe péristaltique pour faire circuler l’aCSF à travers les deux chambres, et une plaque froide thermoélectrique Peltier pour refroidir ou chauffer la chambre principale.