Génération d’une culture neuronale à ultra-faible densité à l’aide d’une couche nourricière neuronale à haute densité

Commencez avec deux plaques multipuits : l’une avec un fond gravé recouvert d’un polymère et l’autre avec une lamelle recouverte de polymère.

Ensemencez une suspension à haute densité des neurones embryonnaires dans la plaque avec le fond gravé. Ajoutez une suspension de neurones à ultra-faible densité dans le couvercle contenant le puits.

Incuber pour permettre la fixation neuronale aux polymères.

Retirez la lamelle et placez-la sur la culture de neurones à haute densité, permettant aux neurones de se faire face.

La surface gravée avec des structures surélevées crée un micro-espace qui sépare les neurones de différentes densités.

La culture à haute densité agit comme une couche nourricière et sécrète le facteur de croissance neuronale.

En raison de l’espace de diffusion confiné, les facteurs de croissance s’accumulent autour des neurones, facilitant leur croissance et le développement des projections neuronales.

Introduire un milieu neurobasal avec de la cytosine arabinoside qui inhibe sélectivement la croissance des cellules non neuronales.

Remplissez régulièrement avec un milieu neurobasal frais pour maintenir la culture neuronale.

Dans cette procédure, placez des plaques à 24 puits avec des fonds gravés pour les neurones à haute densité dans le capot de culture. Retirez 300 microlitres du fluide préconditionné sous vide. Ensuite, mettez en plaque 0,6 millilitre de suspension cellulaire à haute densité à 250 000 neurones par millilitre.

Placez les autres plaques de 224 puits avec lamelles dans la hotte de culture. Retirez 300 microlitres du milieu préconditionné sous vide, avant de plaquer 0,6 millilitre de suspension cellulaire à faible densité à 10 000 neurones par millilitre sur les lamelles. Ensuite, retournez toutes les plaques de 24 puits dans l’incubateur et incubez pendant deux heures. Après cela, retournez les lamelles de faible densité avec des neurones adhérents à la culture à haute densité et assurez-vous que les neurones sont face à face. Par la suite, remettez les deux plaques en coculture dans l’incubateur.

Nourrissez les co-cultures en ajoutant 300 microlitres de milieu d’alimentation frais à la DIV 5. Après cette première alimentation, ajoutez 300 microlitres de milieu d’alimentation frais sans cytosine arabinoside dans chaque puits chaque semaine. Si la culture est conservée pendant plus d’un mois, remplacez la moitié du milieu par du milieu frais chaque semaine, au-delà d’un mois.