Encyclopédie des expériences JoVE
Neuroscience
0 vues • 2:18 min • July 8th, 2025
Commencez avec une plaque multi-puits contenant des cellules souches pluripotentes humaines adhérentes avec une capacité de différenciation multilignée.
Introduisez un milieu de cellules souches contenant du diméthylsulfoxyde ou DMSO.
Le DMSO pénètre dans les cellules et empêche la progression du cycle cellulaire de l’écart 1, ou phase G1, une étape initiale du cycle cellulaire, à la synthèse, ou phase S.
Cela crée une population uniforme de cellules dans la phase G1, améliorant ainsi leur capacité de différenciation.
Remplacez le milieu par un milieu de différenciation ectodermique riche en nutriments contenant des inhibiteurs des voies de signalisation BMP et TGF-β.
Ces inhibiteurs se lient à des récepteurs ALK spécifiques sur les cellules souches, bloquant les voies de signalisation BMP et TGF-β et empêchant leur différenciation en précurseurs de l’endoderme et du mésoderme.
Cela permet la différenciation sélective des cellules souches arrêtées par G1 en précurseurs ectodermiques possédant une capacité de différenciation neurale.
Remplacez régulièrement le milieu par un milieu frais pour maintenir les niveaux de nutriments et de facteurs de différenciation, assurant ainsi la survie cellulaire.
Prétraiter les cellules avec du DMSO comme décrit pour les cultures 2D et préparer Noggin et SP431542 solutions mères. Préparez suffisamment de sérum de remplacement à 10 % ou KOSR dans le DMEM pour trois à quatre jours de changement de milieu. Préparez le milieu de différenciation ectodermique en ajoutant du Noggin et du SP431542 au DMEM KOSR knock-out préchauffé comme décrit dans le manuscrit.
Après le prétraitement au DMSO, aspirez le milieu des cellules et ajoutez 2 millilitres de milieu de différenciation dans chaque puits. Laissez les cellules incuber pendant trois à quatre jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone, en remplaçant quotidiennement les milieux par de nouveaux facteurs de différenciation.