Marquage de marqueurs de surface de cellules neurales avec de l’azidosucre lors de la co-culture avec des cellules endothéliales

Commencez par ajouter une suspension de cellules endothéliales de cerveau de souris à l’insert de membrane perméable d’une plaque transwell.

Ajoutez un milieu de culture au fond et incuber.

Les facteurs de croissance et les nutriments contenus dans le milieu aident les cellules à se développer en tant que monocouche.

Retirez le milieu du puits du fond et de l’insert.

Lavez les surfaces intérieures et extérieures de l’insert pour enlever tous les débris.

Ajoutez un milieu adhérent à l’insert et transférez l’insert dans un puits recouvert d’une matrice contenant des cellules souches neurales et progénitrices corticales primaires, ou NSPC, et incuber.

Ajoutez du sucre azido, un analogue non naturel du précurseur de l’acide sialique, aux cellules endothéliales et aux NSPC, et incubez.

Les cytokines et les chimiokines sécrétées par les cellules endothéliales favorisent la croissance des NSPC en grands clones en forme de feuille.

Les azidosucres s’intègrent dans les structures sialoglycanes à la surface de la cellule NSPC, marquant la glycoprotéine. Cela permet d’identifier les protéines de surface cellulaire sur les NSPC expansées.

Pour préparer les cellules endothéliales, mettez en suspension une pastille de cellules BEND3 à partir d’une boîte de Pétri de 0,10 centimètre à 90 % de confluence avec 9 millilitres de milieu cellulaire BEND3. Ajoutez 1 millilitre de suspension cellulaire dans un insert de support perméable. Ajoutez encore 2 millilitres de milieu BEND3 par puits dans la chambre inférieure de la matrice. Continuez à cultiver les cellules pendant une journée à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Un jour après avoir plaqué les cellules dans les inserts, aspirez doucement le fluide, d’abord à partir de la chambre inférieure, puis des inserts. Lavez la face des inserts trois fois avec du DMEM préchauffé. Lavez la surface extérieure des inserts en rinçant avec du DMEM préchauffé. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de AM préchauffé dans un en-tête. Transférez les inserts dans les puits contenant des cellules corticales primaires. Incuber la co-culture à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 12 heures.

Dissoudre l’Ac₄ManNAz dans le DMSO pour obtenir une concentration de stock de 200 millimolaires. Récupérez la plaque de co-culture endothéliale neurale de l’incubateur. Ajoutez 1 microlitre de stock Ac₄ManNAz dans chaque chambre inférieure et 0,5 microlitre par insert dans la co-culture. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 5 jours. Pendant que les cellules sont en culture, ajoutez 100 microlitres de RM par insert et 200 microlitres de RM par chambre inférieure pour réalimenter les cellules endothéliales et neurales tous les deux jours.