Encyclopédie des expériences JoVE
Neuroscience
0 vues • 2:42 min • July 8th, 2025
Placez une préparation neuromusculaire de larve de drosophile vivante dans une chambre d’enregistrement contenant une solution saline sans calcium.
Les neurones larvaires expriment un canal cationique sensible à la lumière.
Passez à une solution saline de calcium ajouté contenant un colorant fluorescent.
Le colorant est faiblement fluorescent à l’état non intériorisé, mais fortement lorsqu’il est intériorisé par les neurones.
Illuminez la larve avec de la lumière bleue.
Cela active le canal, induisant un afflux de cations et une dépolarisation des neurones, initiant un potentiel d’action.
Le potentiel d’action atteint la terminaison synaptique au niveau de la jonction neuromusculaire, permettant l’afflux de calcium et l’exocytose vésiculaire.
Par la suite, la membrane liée au colorant est internalisée lors du recyclage des vésicules.
Laver avec une solution saline sans calcium pour arrêter le recyclage des vésicules et éliminer tout colorant non internalisé.
Visualisez le signal de fluorescence.
Ensuite, introduisez une solution saline sans colorant et ajoutez du calcium, puis illuminez à nouveau.
Cela induit un autre potentiel d’action, l’afflux de calcium et l’exocytose des vésicules contenant un colorant.
Visualisez à nouveau le signal.
La libération de colorant due à l’exocytose de la vésicule réduit la fluorescence par rapport à l’état lors de l’internalisation de la vésicule.
Pour la stimulation par channelrhodopsin, fixez une LED bleue à un stimulateur programmable à l’aide d’un câble coaxial et placez la LED dans le port de la caméra. Focalisez le faisceau lumineux LED bleu sur la préparation avec un colorant FM à l’aide de la fonction Zoom du microscope.
L’étape la plus critique à ce stade de la procédure est de s’assurer que les paramètres de la LED sont maintenus constants et que vous éclairez la même partie de chaque animal pour toutes les conditions comparées afin d’assurer une force de stimulation constante.
Démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec la minuterie pendant la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique. Lorsque la minuterie s’arrête, retirez rapidement la solution de colorant FM et remplacez-la par une solution saline sans calcium pour arrêter le cycle SV. Pour le déchargement du colorant FM, démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec la minuterie pendant la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique. À la fin de la période de minuterie, retirez rapidement la solution de colorant FM et remplacez-la par une solution saline sans calcium pour arrêter le cycle SV.