Détection des dérivés réactifs de l'oxygène

Espèces réactives de l’oxygène produits dans les cellules ont été impliqués dans l’homéostasie tissulaire, vieillissement cellulaire et États de maladie comme le cancer. Comme leur nom l’indique, ces molécules proviennent de l’oxygène, qui existe naturellement comme une molécule de dioxygène stable, puisque tous ses électrons sont appariés. L’ajout d’un électron non apparié, ce qui la rend instable et conduit à la formation de l’anion superoxyde — une forme d’espèces réactives de l’oxygène ou ROS. Autre que l’anion superoxyde, il y a plusieurs types d’espèces réactives avec des électrons non appariés, dont la cellule a pour objectif de contrôler étroitement les niveaux.

Dans cette vidéo, nous apprendrons comment oxygénées espèces sont reliées au métabolisme et maladie des cellules, explorer les principes qui sous-tendent un test permettant sa détection en utilisant une sonde fluorescente et nous irons via un protocole généralisé avec ce test. Enfin, nous allons étudier comment les scientifiques mettent en œuvre cette méthode au cours d’expériences aujourd'hui.

Tout d’abord, nous allons discuter comment oxygénées espèces sont produites et tenir compte de leur influence dans le métabolisme cellulaire et la maladie.

Une source importante d’espèces oxygénées radicalaires cellulaire est la mitochondrie. Normalement, au cours de la cellule électrons de métabolisme sont transportés par une chaîne de complexes protéiques, aboutissant à la réduction de l’oxygène moléculaire dans l’eau et la production simultanée d’ATP. Malgré le règlement extraordinaire de ce processus, les électrons fuient, entraînant la formation d’un anion superoxyde.

La présence de l’anion superoxyde donne rapidement naissance à d’autres formes d’espèces réactives de l’oxygène, tels que le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle. Ces radicaux, qui tous possède un électron non apparié très réactif, peut endommager par oxydation de membranes, l’ADN et les protéines. Pour contrer, la cellule maintient son propre stock d’antioxydant d’enzymes comme la superoxyde dismutase ou molécules comme la vitamine C, qui réduisent les radicaux libres. Tout déséquilibre dans ce système de défense peut entraîner une boucle de rétroaction positive potentiellement mortelle, résultant en un état de trop reactive oxygen species, connu comme le stress oxydatif.

Les espèces réactives de l’oxygène ont été impliqués dans l’initiation et la progression du cancer. Un autre effet nocif de ces molécules est l’induction du vieillissement cellulaire, aussi connu sous le nom de sénescence. Les « radicaux libres théorie du vieillissement » propose que des espèces oxygénées réactives produites dans les cellules au cours du métabolisme normal évoquent la mort et la sénescence cellulaire.

Jusqu'à présent, nous avons discuté les aspects négatifs de ces molécules très réactives, mais ils jouent un rôle positif dans la physiologie cellulaire aussi bien. Au cours de la réponse immunitaire lors de phagocytes engloutissent pathogènes, cellules Mont un « éclat respiratoire » au cours de laquelle des quantités excessives d’espèces oxygénées réactives sont générées afin de dégrader par oxydation des agents pathogènes. En outre, ils sont des intermédiaires nécessaires et régulateurs d’une variété de voies de signalisation cellulaire et peuvent même signal la mort des cellules cancéreuses se sont tournés.

Afin de quantifier ces oxydants cellulaires influents, scientifiques exploitent les molécules qui, après oxydation transforment fluorescents. Une sonde utilisée pour détecter les espèces réactives de l’oxygène est H₂DCFDA ou dichloro-dihydro-fluorescéine diacétate, un analogue non fluorescent de fluorescéine. Lors de l’ajout de cellules, sa cellule perméants nature lui permet de diffuser passivement dans.

Puis, estérases intracellulaires catalysent une réaction d’hydrolyse, qui se traduit par clivage des groupes acétates. Cela rend le composé plus polaire, alors qu’il est conservé au sein de la cellule. Lors de l’oxydation, qui implique la suppression des atomes d’hydrogène par un large éventail d’espèces réactives de l’oxygène, le H2DCFDA non fluorescent est converti en la très fluorescent dichloro-fluorescéine ou DCF. Ceci peut être lu et quantifiée par un lecteur de plaque, cytomètre en flux ou la microscopie de fluorescence.

Maintenant que vous savez comment fonctionne ce test, nous allons voir comment il est effectué dans un laboratoire.

Commencer par le transfert de cellules cultivées en milieu de culture à solution saline tamponnée au phosphate, suivi par centrifugation pour les laver. Éliminer le surnageant et ajouter la solution DCFDA la sonde fluorescente H₂. Incuber les cellules chargées de colorant dans l’obscurité pour empêcher le photoblanchiment. Après incubation, laver les cellules pour déloger les cellules de colorant et transfert déchargés sur une plaque. À ce stade, les inducteurs de stress oxydatif expérimental peuvent être ajoutés.

Lorsque vous êtes prêt pour l’analyse, les cellules peuvent être insérés dans le lecteur. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont définies pour la fluorescéine. Après la lecture des plaques, les valeurs peuvent être analysés. Résultats révèlent la quantité relative des espèces réactives de l’oxygène entre les échantillons à des moments particuliers.

Maintenant que nous avons examiné le protocole actuel, nous allons regarder comment il est appliqué dans les expériences aujourd'hui.

Les chercheurs utilisent souvent cette méthode pour étudier les mécanismes de la phagocytose. Ce groupe de scientifiques voulu étudier la capacité du poisson-zèbre à monter une immuno-réaction à différents stades de développement. Comme mentionné précédemment, les résultats de la phagocytose dans la génération d’espèces réactives de l’oxygène élevée, ou « un éclat respiratoire », qui est utilisé pour détruire les agents pathogènes. Puisque l’enzyme oxydase de NADPH est un important producteur ROS dans les cellules phagocytaires, ces scientifiques induite par la réaction de sursaut en traitant le poisson-zèbre avec un inducteur de NADPH. Les résultats ont démontré que chez les embryons de poisson-zèbre dont la réponse « burst » avait été provoquée, ceux à la fertilisation après 72 heures montrent développement d’espèces réactives de l’oxygène supérieur à celles de 48 heures après la fécondation.

Dysfonctionnement mitochondrial dues aux espèces réactives de l’oxygène accru est une caractéristique pathologique de nombreuses maladies. Par conséquent, les chercheurs peuvent déterminer le dysfonctionnement mitochondrial en mesurant le niveau de stress oxydatif. Ici, les scientifiques chargement des H2DCFDA sur les neurones et ensuite monté les échantillons sur un microscope à fluorescence. Sur l’ajout d’un facteur de stress oxydatif, comme le peroxyde d’hydrogène, corps cellulaires affiche une augmentation soudaine de la fluorescence, qui pourrait être une indication de dysfonctionnement mitochondrial.

Les astrocytes ont été suggérées pour protéger les neurones du système nerveux central contre le stress oxydatif. En raison de cette importance, ces chercheurs visant à développer un test pour détecter le stress oxydatif dans les astrocytes en présence d’un inducteur externe. Ils ont fait cela en incubant des astrocytes avec peroxyde d’hydrogène et la sonde fluorescente pour la détection d’espèces réactives de l’oxygène. Subséquente fluorescence générée a été analysée à l’aide d’un cytomètre en flux. Astrocytes activés pour le stress oxydatif ont été observés à l’automne dans une région de l’intensité de fluorescence accrue, vue décalée vers la droite.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la détection des espèces réactives de l’oxygène ou ROS. Pour résumer, dans cette vidéo, nous avons analysé le lien entre les espèces réactives de l’oxygène, le métabolisme cellulaire et la maladie. Nous avons ensuite examiné le principe et la procédure d’un test de détection des espèces réactives de l’oxygène. Enfin, nous avons examiné comment les chercheurs appliquent cette méthode à leurs enquêtes. L’analyse des rôles toujours énigmatiques des espèces réactives de l’oxygène est d’un grand intérêt pour les biologistes cellulaires et mesure fiable avec des sondes fluorescentes s’avère très utile. Comme toujours, Merci pour regarder !