Name: CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez l'édition génomique multiplex de Saccharomyces cerevisiae par CRISPR/Cas12a utilisant un seul array de crRNA. Cette méthode sans clonage permet d'introduire simultanément plusieurs cassettes d'expression pour produire des caroténoïdes colorés.

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Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de l'accord de subvention no 686070 (DD-DeCaf) et 764591 (SynCrop), et du programme de recherche Building Blocks of Life avec le numéro de projet 737.016.005 par l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO). T.E.G. a reçu l'appui de la Royal Society (grant UF160357) et de BrisSynBio, un CENTRE de recherche en biologie synthétique BBSRC/EPSRC (subvention BB/L01386X/1). Nous remercions Zi Di et Jeffrey van Wijk pour leur contribution aux expériences de repérage de levurepour la création de l'art pixel de levure.

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Les auteurs déclarent qu'il y a conflit d'intérêts. Les auteurs ont déposé la propriété intellectuelle liée aux méthodes présentées.

Le protocole fourni décrit l'édition du génome multiplex de S. cerevisiae à l'aide de Cas12a de la bactérie Lachnospiraceae ND2006 en combinaison avec un tableau unique de crRNA et l'ADN du donneur. La conception du tableau de crRNA unique et de l'ADN de donneur est expliquée en détail. Contrairement au système CRISPR/Cas9 bien établi, le CRISPR/Cas12a a la capacité supplémentaire unique de traiter plusieurs crARN exprimés à partir d'un seul tableau crRNA13,33. Grâce à cette fonctionnalité, l'édition simultanée de plusieurs cibles est plus facile à configurer et peut être réalisée en une seule transformation. Cette approche de tableau de crRNA simple a été démontrée avant par Zetsche etautres. 34 qui ont simultanément édité jusqu'à quatre gènes dans les cellules de mammifères en utilisant AsCas12a, et par Swiat et al. 35 qui ont introduit quatre fragments d'ADN dans un génome de levure en utilisant FnCas12a. À notre connaissance, un plus grand nombre de modifications génomiques simultanées utilisant un système Cas12a n'a pas été signalée et la limite maximale de cibles par tableau unique pour Cas12a n'a pas encore été déterminée. D'autres recherches utilisant des tableaux de crRNA simples en combinaison avec Cas12a inclut la régulation transcriptionnelle multiplex dans un large éventail d'organismes33,36,37.
Il y a quelques étapes critiques dans le protocole présenté. Concevez soigneusement toutes les séquences d'ADN qui sont impliquées dans l'expérience d'édition du génome Cas12a, en particulier dans le cas où de nouvelles séquences d'ADN sont introduites. Déterminer la fonctionnalité des nouvelles séquences d'espaceurs faisant partie d'un crRNA, par exemple par une expérience d'édition du génome singleplex telle que décrite par Verwaal et al. 19 avant de les combiner en un seul tableau crRNA. Suivez les recommandations pour la préparation des solutions tampon de transformation utilisées dans l'expérience d'édition Cas12a pour atteindre une bonne efficacité de transformation de la levure.
Il y a quelques modifications facultatives de la technique. Il est recommandé d'utiliser 1 g de chaque ADN de donneur, pRN1120 linéaire ou cassette d'expression de tableau de crRNA unique dans la transformation, bien que l'utilisation d'une quantité inférieure d'ADN devrait également avoir comme conséquence une efficacité satisfaisante de transformation. Effectuer une transformation de test pour déterminer si des quantités d'ADN plus faibles peuvent être utilisées. La transformation de S. cerevisiae pourrait être effectuée en utilisant une méthode différente de celle décrite dans ce protocole, par exemple le protocole décrit par Gietz et al. (2007) 38. Le plasmine plasmide pRN1120 du récepteur d'ARN guide convient à l'expression d'un seul crRNA et d'un tableau unique de crRNA de différentes variantes De12a(p. ex., d'Acidaminococcus spp. BV3L6 ou Francisella novicida U112) ainsi que pour l'expression de sgRNA en combinaison avec Cas919. L'ADN du donneur n'a pas besoin d'être limité aux cassettes d'expression génique caroténoïdes et aux régions de flanc qui ciblent l'ADN des donneurs aux sites INT1, INT2 et INT3 décrits dans l'ADN génomique. Tout ADN d'intérêt peut être introduit, de manière multiplexe, dans l'ADN génomique de l'hôte par les principes de conception décrits dans ce protocole, ou alternativement l'ADN de donneur peut être utilisé pour supprimer l'ADN d'un génome hôte. La structure modulaire du tableau de crRNA simple facilite l'ajustement des séquences d'espaceur et de répétition directe. La modification des séquences d'espaceur permet de modifier le lieu d'intégration prévu qui peut être conçu par l'un des outils d'identification d'un site cible génomique, par exemple le logiciel GuideScan 1.039. Au lieu d'utiliser de grandes séquences de flanc qui contiennent des séquences de connecteurs, 50 pb de la région de flanc peuvent être inclus dans les séquences d'ADN des donneurs en incorporant ces séquences de région de 50 pb dans les amorces utilisées dans le PCR. Dans ce cas, au total seulement trois au lieu de neuf fragments d'ADN de donneur sont nécessaires pour une expérience réussie d'édition de génome de multiplexe.
En résumé, ce protocole fournit des instructions étape par étape pour effectuer l'édition du génome multiplex dans S. cerevisiae en utilisant Cas12a en combinaison avec une approche de tableau crRNA unique. Le protocole a été démontré par l'édition du génome multiplexe à l'aide de 9 fragments d'ADN de donneur et d'un seul codage de tableau de crRNA pour trois gRNAs. Nous montrons des fréquences d'édition globales élevées entre 50% et 94% pour les trois conceptions de contrainte rapportées ici. En conclusion, la caractéristique unique de Cas12a est la possibilité de traiter un seul tableau crRNA en CRRNAs individuels dans une cellule, ce qui fait cas12a un excellent outil pour permettre l'édition du génome multiplex et de développer des modules de régulation transcriptionnelle ciblant plusieurs cassettes d'expression en une seule fois. En fin de compte, trois souches ont été obtenues produisant des caroténoïdes à un niveau différent et des couleurs dans des tons entre le jaune et l'orange. Avec ces souches et une souche de type sauvage, nous avons montré comment un gestionnaire de liquide acoustique peut être utilisé directement pour faire de l'art pixel levure - ce en l'honneur de Rosalind Franklin qui a contribué à la découverte de la structure de l'ADN il ya 65 ans par sa célèbre photo 5123 /c1.

Les enzymes CRISPR/Cas ont incontestablement révolutionné la biologie moléculaire et ont été largement adoptées comme outils pour l'ingénierie des génomes à une vitesse qui était auparavant irréalisable1. La première modification d'un génome de Saccharomyces cerevisiae par le système d'édition du génome CRISPR/Cas9 a été rapportée par DiCarlo et al. 2, démontrant le knock-out réussi de gène et faisant des mutations de point utilisant des oligonucléotides introduits externement. D'autres développements de boîte à outils de la levure CRISPR inclus: régulation transcriptionnelle par fusion de Catalyically inactif mort Cas9 (dCas9) avec des domaines effecteurs transcriptionnels pour permettre l'activation et le silence de la transcription3, application pour les deux l'édition du génome et les fonctions réglementaires pour l'ingénierie des voies métaboliques par activation simultanée, répression et suppression4, suppression de gros fragments du génome de S. cerevisiae 5, et fusions multichromosome6 .
Les systèmes d'édition du génome CRISPR/Cas trouvent leur origine dans les systèmes immunitaires adaptatifs des bactéries et des archées et ces systèmes ont été adaptés par des biologistes moléculaires pour l'édition du génome. Leur fonctionnalité est basée sur les régions d'ADN de répétitions palindromic courtes (CRISPR) encodant l'ARN de l'ADN ou de l'ARN étranger et les gènes associés au CRISPR (Cas) qui codent l'ARN-guidé endonucleases1,7,8,9. Sur la base de l'analyse récente du génome des systèmes CRISPR/Cas, il a été proposé de diviser les systèmes CRISPR/Cas en deux classes, cinq types et 16 sous-types10. Les deux classes sont distinguées en fonction de l'organisation de complexes effecteurs impliqués dans le clivage cible. En règle générale, les systèmes CRISPR/Cas dotés d'une organisation multi-sous-unitit sont classés en classe 1, tandis que les complexes d'effecteurs de sous-unité unique appartiennent à la classe 210,11. Dans cet article, nous explorons la classe 2 de type V Cas12a, anciennement appelé Cpf110,12, qui est une alternative à la classe 2 type II Cas9. Bien que Cas9 est bien caractérisé et largement utilisé dans la recherche, Cas12a offre des fonctionnalités supplémentaires12. Tout d'abord, Cas12a forme un complexe avec DE l'ARN CRISPR (ARN) de 42 à 44 nucléotides sans avoir besoin d'un ARN CRISPR transactivant supplémentaire (tracrRNA). Par conséquent, un ARN guide plus court peut être utilisé dans l'édition du génome avec des systèmes CRISPR/Cas12a par rapport à CRISPR/Cas9. Deuxièmement, l'activité unique d'endouclease et d'endoribonuclease de Cas12a permet la maturation de son pré-crRNA13. Cette activité RNase permet l'encodage de plusieurs CRRNAs sur un seul tableau DE CRRNA CRISPR, tandis que Cas9 nécessite l'expression séparée de chaque ARN dit unique (sgRNA) ou alternativement par exemple l'expression d'une endonuca supplémentaire ( p. ex., Csy4) en combinaison avec des motifs de reconnaissance pour Csy4 entourant chaque sgRNA14,15. Troisièmement, la reconnaissance du site cible Cas12a nécessite un motif adjacent protospacer (PAM) à l'extrémité 5' de la cible et s'enprend après la position de 18/23 de son PAM résultant en l'ADN clivé avec des extrémités collantes, tandis que Cas9 nécessite un PAM situé sur l'extrémité 3' de la cible et s'enlisse après la position -3 créant des coupes d'extrémité émoussées dans l'ADN12. Quatrièmement, la séquence de nucléotide de consensus de la PAM diffère entre Cas12a ((T)TTV) et Cas9 (NGG), ce qui fait cas12a un candidat prometteur pour cibler les séquences de promoteur et de terminaison T-rich16. Enfin, une étude récente a fait état d'une plus grande spécificité cible pour Cas12a que pour le Cas917natif .
Nous présentons un protocole pour l'utilisation du système CRISPR/Cas12a pour l'édition du génome de S. cerevisiae avec un accent particulier sur l'introduction de cassettes d'expression d'ADN multiples dans des loci génomiques indépendants simultanément (édition du génome multiplex) en utilisant un tableau crRNA unique. Les étapes clés du protocole sont représentées à la figure 1. Comme preuve de concept, le système CRISPR/Cas12a a été appliqué pour l'introduction de trois cassettes d'expression dans le génome de S. cerevisiae qui permettent la production de carotène18 comme le montre schématiquement la figure 2. La production de carotène affecte le phénotype de S. cerevisiae: c.-à-d., lors de l'introduction réussie des trois gènes hétérologues requis pour la biosynthèse des caroténoïdes, les cellules blanches de S. cerevisiae deviennent jaunes ou oranges, en fonction de la force d'expression du promoteur de chaque gène. En raison de la simple lecture visuelle de cette voie, il a été introduit pour développer des systèmes et des méthodes avancés à base de CRISPR pour l'édition du génome19,20. Dans ce travail, cassettes d'expression codant les gènes caroténoïdes crtE, crtYB et crtI ont été construits à l'aide d'un clonage Golden Gate (GGC) approche21 avec des promoteurs hétérologues et terminators homologues utilisé pour stimuler l'expression des gènes. Les cassettes d'expression sont entourées de séquences uniques de paires de 50 bases (bp), appelées connecteurs, qui permettent un assemblage in vivo avec des séquences d'ADN de flanc d'intégration (régions de flanc) avec les mêmes séquences de 50 pb, et l'intégration ultérieure dans l'ADN génomique de levure à la position déterminée par les régions de flanc. En utilisant différentes forces de promoteur, des souches avec différents niveaux de production de caroténoïdes ont été obtenues résultant en une variation de la couleur des cellules. Ces souches - inspirées par le "Yeast Art Project"22 - ont été utilisées dans une installation de repérage avec un gestionnaire de liquide acoustique pour créer une 4 couleurs haute résolution "photographie de levure" de Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) était une chimiste anglaise et cristallographe à rayons X bien connue pour sa contribution à la découverte de la structure de l'ADN par la photo 5123,24,25.

<table><tbody><tr><td>Produits chimiques spécifiques au protocole</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus Échelle d’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td>Électrophorèse</td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td>Sélection de transformants E. coli</td></tr><tr><td>BsaI-HF (20 U/&micro ; l)</td><td>New England BioLabs</td><td>R353L</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>Cell Lysis Solution (du kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>Isolement de l’ADN génomique de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td>Linéarisation du sel de sodium de l’acide désoxyribonucléique pRN1120</td></tr><tr><td>à partir de testicules de saumon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1626</td><td>Transfromation de S. cerevisiae (ADN porteur)</td></tr><tr><td>dNTPs,</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>PCRs,</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td>, <td>New England BioLabs</td><td>, R3101S</td><td>Linéarisation de pRN1120 Absolu d’éthanol</td></tr><tr><td>pour l’analyse</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Isolement de l’ADN génomique de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine-tétraacétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DE</td><td>Transformation de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>G418 disulfate</td><td>sel Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td>Sélection de transformants S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158&nbsp ;</td><td>Pixel art levure</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>100993</td><td>Isolement de l’ADN génomique de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Acétate de lithium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6883</td><td>Transformation de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Nancy-520 DNA Gel Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1494</td><td>Électrophorèse</td></tr><tr><td>NEB10 cellules E. coli compétentes</td><td>New England BioLabs</td><td>C3019H</td><td>Transformation d’E. coli : dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB102</td><td>Sélection de transformants de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Tampon de phosion</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCRs</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 4000</td><td>Merck</td><td>7490</td><td>Transformation de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (du kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>Isolement de l’ADN génomique de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Purple loading dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td>Electrophoresis</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Purification des plasmides</td></tr><tr><td>RNase coctail enzyme mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>Isolement de l’ADN génomique de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>T4 Tampon d’ADN ligase</td><td>Invitrogen</td><td>46300-018</td><td>Golden Gate Clonage de l’ADN</td></tr><tr><td>T4 ligase (1 U/&micro ; l)</td><td>Invitrogen</td><td>1705218</td><td>Golden Gate Clonage</td></tr><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Electrophoresis</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Purification des produits PCR et linéarisés pRN1120</td></tr><tr><td>Xhol</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Linéarisation de la zymolyase pRN1120</td></tr><tr><td>50 mg/ml (5 unités/&micro ; L)</td><td>Zymo Research</td><td>E1006</td><td>Isolement de l’ADN génomique de S. cerevisiae (enzyme de lyse de levure)</td></tr><tr>Tampon de stockage de la <td>zymolyase</td><td>Zymo Research</td><td>E1004-B</td><td>Isolement de l’ADN génomique de S. cerevisiae (nécessaire à la préparation de l’enzyme de lyse de levure)</td></tr><tr><td><fort>Produits chimiques d’usage général</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2*Gélose</td><td></td><td></td> à l’extrait de peptone de levure (PY) <td>Plaque croissance d’E. coli</td></tr><tr><td>2*PY milieu</td><td></td><td></td><td>Culture d’E. coli</td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td> déminéralisée <td>Transformation de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> ELFO <td>Électrophorèse</td></tr><tr><td>MQ</td><td></td><td></td><td>Étapes multiples</td></tr><tr><td>Solution saline</td><td></td><td></td><td>physiologique Transformation de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>TE </td><td></td><td></td> tampon <td>Stockage de l’ADN, transformation de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Extrait de levure-peptone-dextrose (YEPD ; 2 % de glucose) milieu</td><td></td><td></td><td>Culture de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>YEPD (2 % de glucose) gélose</td><td></td><td></td><td>Croissance en plaque de S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon (50 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplaque 96 puits Boîtes de</td> Pétri Pointes <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de pipette 0,5 - 10 & micro ; </td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>Pointes de pipette 10 - 200 & micro ; </td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>Pointes de pipette 100 - 1000 & micro ; </td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>Flacons agitateurs (500 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtres stériles <forts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>>Matériel</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse (tubes Falcon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> acoustique pour manipulateurs <td></td><td></td><td></td>de liquides Echo 525</tr><tr><td>NanoDrop</td><td></td><td></td><td></td></tr> Set pour <tr><td>spectrophotomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’élétrophorèse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table (tubes Eppendorfs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Plasmides</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCSN067</td><td>Addgene</td><td>ID 101748</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr> <tr><td>pRN1120</td><td>Addgene</td><td>ID 101750</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr><tr><td><fortes>souches</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae souche CEN. PK113-7D</td><td>EUROSCARF collection</td><td></td><td>http://www.euroscarf.de</td></tr></tbody></table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art crispr

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

L'efficacité élevée, la facilité d'utilisation et la polyvalence du système de répétitions palindromic courtes et de courte durée interespacement interespacement interspaced/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) a facilité la modification génétique avancée de Saccharomyces cerevisiae, un modèle l'organisme et le cheval de bataille de la biotechnologie industrielle. La protéine 12a (Cas12a), une endodoucane guidée par l'ARN dont les caractéristiques se distinguent de Cas9 est appliquée dans ce travail, élargissant davantage la boîte à outils moléculaire à des fins d'édition du génome. Un avantage du système CRISPR/Cas12a est qu'il peut être utilisé dans l'édition du génome multiplexe avec plusieurs ARN guides exprimés à partir d'une seule unité transcriptionnelle (single CRISPR RNA (crRNA) tableau). Nous présentons un protocole pour l'intégration multiplexe des gènes hétérologues multiples dans les loci indépendants du génome de S. cerevisiae utilisant le système CRISPR/Cas12a avec les crRNAs multiples exprimés à partir d'une construction unique de tableau de CRRNA. La méthode proposée exploite la capacité de S. cerevisiae à effectuer une recombinaison in vivo de fragments d'ADN pour assembler le tableau de crRNA unique en un plasmide qui peut être utilisé pour la sélection des transformateurs, ainsi que l'assemblage de l'ADN du donneur séquences qui s'intègrent dans le génome aux positions prévues. Cas12a est pré-exprimé constitutivement, facilitant le clivage du génome de S. cerevisiae aux positions prévues sur l'expression du tableau unique de crRNA. Le protocole comprend la conception et la construction d'un tableau unique de crRNA et de cassettes d'expression d'ADN des donneurs, et exploite une approche d'intégration faisant usage de séquences uniques de connecteurs d'ADN de 50 pb et de séquences d'ADN séparées de flanc d'intégration, ce qui simplifie conception expérimentale par la normalisation et la modularisation et élargit la gamme d'applications. Enfin, nous démontrons une technique simple pour créer l'art de pixel de levure avec un gestionnaire acoustique liquide utilisant le caroténoïde différemment coloré produisant des souches de levure qui ont été construites.

Le protocole pour l'édition du génome multiplex à l'aide de CRISRP/Cas12a a été démontré en construisant trois souches caroténoïdes produisant S. cerevisiae exprimant les gènes crtE, crtYB et crtI en utilisant des promoteurs hétérologues de résistance élevée, moyenne et faible : souche 1, 2 et 3 respectivement (tableau supplémentaire 3). La construction de ces souches a nécessité la production de trois cassettes d'expression d'ADN des donneurs et de six régions de flanc par souche pour cibler trois loci différents dans l'ADN génomique (indiqué à la figure 2B). Comme décrit ci-dessus, le promoteur, le cadre de lecture ouvert, le terminateur et deux séquences de connecteurs contigus de 50 pb ont été assemblés dans une cassette d'expression par l'intermédiaire d'une réaction de clonage golden Gate et l'assemblage a été vérifié par PCR (Figure 3A). Le tableau de crRNA unique a été commandé comme fragment d'ADN synthétique et a été amplifié par PCR (Figure 3B). Le plasmide receveur pour le tableau de crRNA unique (plasmid pRN1120) a été linéaire avec EcoRI-HF et XhoI et la linéarisation a été confirmée par électrophorèse (figure 3C). La conception et les séquences de nucléotides des cassettes d'expression d'ADN des donneurs introduits et des régions de flanc sont présentées dans le tableau 3 et le tableau supplémentaire 4. La séquence des cassettes d'expression de tableau de crRNA simple est fournie dans le tableau supplémentaire 1. La fonctionnalité des espaceurs inclus dans le tableau crRNA unique a été testée à l'avance par l'édition du génome singleplex avec des crRNAs individuels19.
L'efficacité de l'édition du génome à l'aide de Cas12a a d'abord été évaluée en fonction du nombre de colonies colorées obtenues après la transformation (tableau 1, figure 4). L'efficacité d'édition des trois souches construites variait de 50 % à 94 %. Notamment, l'introduction de cassettes d'expression utilisées pour générer la souche 1 a montré la plus faible efficacité d'édition, peut-être causée par la nature de l'ADN du donneur(c.-à-d., ces cassettes d'expression codecr crtE, crtYB et crtI de trois promoteurs de haute résistance). Deuxièmement, l'intégration correcte des trois cassettes d'expression d'ADN des donneurs au loci prévu sur l'ADN génomique a été confirmée par PCR (figure 5). Les amorces ont été conçues de telle sorte que les produits PCR ont été obtenus lorsque l'intégration correcte de l'ADN du donneur au lieu prévu s'est produite. Pour chaque expérience de transformation, huit colonies ont été cueillies à partir de la plaque de transformation et testées (à noter que seulement trois sont présentées à la figure 5). En général, sur 8 colonies testées par ADN de donneur, l'intégration correcte de l'ADN du donneur crtE au cri usin1, le crtYB au locus INT2 et le crtI au locus INT3 ont été confirmés dans les transformateurs. Ces résultats démontrent que le système CRISPR/Cas12a en combinaison avec un seul tableau de crRNA permet une édition multiplexe efficace du génome de S. cerevisiae à plusieurs loci simultanément.
En outre, nous démontrons la création de "yeast pixel art" en utilisant les trois souches de production de caroténoïdes qui ont été construits avec une souche de type sauvage non-coloré. À partir d'une image en noir et blanc de Rosalind Franklin (Figure 6A), une image en 4 couleurs (Figure 6B) et la liste de repérage a été créé qui a ensuite été utilisé pour repérer les quatre souches de levure différentes sur une microplaque agar à l'aide d'un gestionnaire de liquide acoustique, résultant en une haute résolution "peinture de levure" de Rosalind Franklin (Figure 6C,D,E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Figure 1 : Flux de travail du protocole pour l'édition du génome du multiplexe CRISPR/Cas12a en S. cerevisiae. Le flux de travail comprend des étapes cruciales de la méthode présentée. Pour plus de détails, consultez le Protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Figure 2 : Schéma d'édition du génome du multiplexe CRISPR/Cas12a à l'aide d'un tableau crRNA unique. (A) Le tableau de crRNA unique est composé de trois unités crRNAs dans leur forme mature, une répétition directe de 20 pb spécifique pour LbCas12a (carrés gris) avec une séquence de guide de 23 pb (diamants de couleur). L'expression du tableau crRNA est activée par le promoteur SNR52 et le terminateur SUP4. La transformation de S. cerevisiae avec un pRN1120 linéaire et la cassette d'expression de tableau de crRNA simple contenant l'homologie avec pRN1120 (bandes diagonales) permet la recombinaison in vivo dans un plasmide circulaire dans les cellules pré-exprimant LbCas12a. Le tableau crRNA unique est ensuite traité par Cas12a. (B) Cas12a est dirigé vers les sites cibles génomiques INT1, INT2 et INT3 prévus et crée des ruptures doubles. Dans le mélange de transformation, l'ADN de distributeur se composant des régions de flanc et de la cassette d'expression de gène caroténoïde ont été inclus. Les assemblages d'ADN des donneurs ont été ciblés sur un tronçon d'ADN dans l'ADN génomique autour de l'INT1 (crtE), INT2 (crtYB) et INT3 (crtI) loci par recombinaison in vivo en raison de la présence de séquences de connecteurs homologues de 50 pb, indiqués comme 5, A, B, C, D ou E. P1-P3, différents promoteurs; T1-T3, différents terminateurs. Ce chiffre a été modifié à partir de Verwaal et al. 201819. Constructions génétiques montrées à l'aide de la biologie synthétique Open Language (SBOL) Symboles visuels40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Figure 3 : PCR vérifiant les expériences d'édition du génome. (A) Vérification des réactions de clonage de la porte d'or des cassettes d'ADN des donneurs assemblés. Les résultats obtenus sont en accord avec les longueurs attendues. (B) PCR du tableau crRNA unique. (C) Linearisation du plasmide pRN1120. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Figure 4 : Plaques de transformations S. cerevisiae en utilisant l'approche d'édition du génome multiplex. (A) Souche 1 exprimant crtE, crtYB et crtI de trois promoteurs forts (colonies orange foncé). (B) Souche 2 exprimant crtE, crtYB et crtI de trois promoteurs de force moyenne (colonies orange). (C) Souche 3 exprimant crtE, crtYB et crtI de trois promoteurs de faible résistance (colonies jaunes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Figure 5 : PCR vérifiant l'intégration des cassettes d'expression d'ADN de distributeur aux loci prévus dans l'ADN génomique. (A) Vérification de trois colonies de la souche 1. (B) Vérification de trois colonies de la souche 2. (C) Vérification de trois colonies de la souche 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Figure 6 : Art de pixel de levure de Rosalind Franklin. (A) Photo RGB en noir et blanc de 220 à 280 pixels de Rosalind Franklin qui a été utilisé comme modèle. (B) Conversion informatique de la photo en noir et blanc de Rosalind Franklin en une liste de 4 couleurs 64 à 96 pixels. (C) Photo de l'art de pixel de levure avec 64 -96 colonies de levure avec une section zoomée-dans. (D) Photo d'un manutentionnaire de liquide acoustique avec deux plaques pleines de croissance. (E) Photo d'une microplaque adulte avec 64 à 96 colonies de levures. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>La souche 1</td>
			<td>Souche 2</td>
			<td>Souche 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonies colorées</td>
			<td>16 Annonces</td>
			<td>279 Annonces</td>
			<td>220 Ans, états-unis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonies blanches</td>
			<td>16 Annonces</td>
			<td>18 ans, états-unis qui</td>
			<td>18 ans, états-unis qui</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonies totales</td>
			<td>32 Ans, états-unis (</td>
			<td>297 Annonces</td>
			<td>238 Annonces</td>
		</tr>
<tr>
<td>efficacité</td>
			<td>50%</td>
			<td>94 %</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Efficacité de montage de l'approche d'édition du génome multiplex.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA tableau séquencea,b,c,d,e,f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
CATGTTTGACAGCTTATCATCATCGATATCCGGAGCTAGCATGCGGCCGCCTAGAACTAGTGGATCCCMGCTGCAG TCTTTGAAAAAA TCTTGAAAAA GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAACTTGATTTTTTTTTTTTTTTGagTATATACAAGG TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTTTTagTGCCCTTTTTGgGCTAGCGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTTCACACCCTACAATGTTTGTTGTTCAAAGATTTTGGTCAACGCTGTAGAGTGAAGtTGGTGCGC ATGTTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAATGATCAATTTCTACTAGTGTAGAT CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTTActAGTGTAGATGTGCCGTAC GCCGGAGCCGACGGAATTTTTACTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATATTTT TTTTTTGTTTTTATGTCTGGGGCCCGGTACCACGCTTTTGTTCCCT GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATTCATAGCTGTTTCCTGTGTGGTGGG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. Homologie à pRN1120 (bold). b. Promoteur SNR52 (italiques). c. Séquences cibles génomiques (soulignées). d. Guide rit en direct répète spécifique pour LbCas12a (italiques, gras). e. SUP4 terminator (italiques). f. Homologie à pRN1120 (bold).</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau supplémentaire 1 : tableau de crRNA simple pour LbCas12a contenant l'homologie avec plasmide pRN1120.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>nom</td>
			<td>Séquencea</td>
			<td>Descriptionb</td>
			<td>Utilisé en point</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATC</td>
			<td>Apprêt FW pour l'amplification du tableau crRNA unique</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>Amorce RV pour l'amplification du tableau crRNA unique</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTTGC AAGCGACTTCCAATCGCTTTTGC AAGAGCGACTTCCAATCGCTTT</td>
			<td>Apprêt FW pour l'amplification de l'ADN du donneur avec connecteur 5</td>
			<td>3.6.1 Annonces</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAGGAGAGAAC AAAGCAAAGGAAA</td>
			<td>Amorce de RV pour l'amplification de l'ADN du donneur avec le connecteur A</td>
			<td>3.6.1 Annonces</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>Apprêt FW pour l'amplification de l'ADN du donneur avec connecteur B</td>
			<td>3.6.1 Annonces</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATATATAC</td>
			<td>Amorce de RV pour l'amplification de l'ADN de donneur avec le connecteur C</td>
			<td>3.6.1 Annonces</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>Apprêt FW pour l'amplification de l'ADN du donneur avec connecteur D</td>
			<td>3.6.1 Annonces</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAAACACACGACCG</td>
			<td>Amorce DE RV pour l'amplification de l'ADN de donneur avec le connecteur E</td>
			<td>3.6.1 Annonces</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTGGCTATATTG</td>
			<td>Amorce FW pour amplification de L'INT1 5' avec connecteur 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTGACTCTTGCCGTC ATTCC (en anglais seulement)</td>
			<td>Amorce RV pour amplification de L'INT1 5' avec connecteur 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTGTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC TTTG (en)</td>
			<td>Amorce FW pour amplification de L'INT1 3' avec connecteur A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>Amorce RV pour amplification de L'INT1 3' avec connecteur A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTTCAATCTCTCC</td>
			<td>Amorce FW pour amplification de l'INT2 5' avec connecteur B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTGTGTGTGTGTGTGTACAT CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC TGGTTG TGGTTG</td>
			<td>Amorce RV pour amplification de L'INT2 5' avec connecteur B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT GACCACAGTGTATCCATCCGCCT CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG GTGG (EN anglais seulement)</td>
			<td>Amorce FW pour amplification de l'INT2 3' avec connecteur C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCCTTCGATGACCGGGGG</td>
			<td>Amorce RV pour amplification de l'INT2 3' avec connecteur C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTTG GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTGGGGG</td>
			<td>Amorce FW pour amplification de l'INT3 5' avec connecteur D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGAATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG AAGAACG (En)</td>
			<td>Amorce RV pour amplification de L'INT3 5' avec connecteur D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
AAATAAAACAACATCCTT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTTGTTGTT GTACCTGATGGGACGTCAGCACT GTAC (En)</td>
			<td>Amorce FW pour amplification de l'INT3 3' avec connecteur E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATTCATTC</td>
			<td>Amorce RV pour amplification de L'INT3 3' avec connecteur E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTGTCCG</td>
			<td>Apprêt FW pour la vérification de l'intégration de con5-crtE-conA à INT1 5'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTTACTTC</td>
			<td>Apprêt FW pour la vérification de l'intégration de con5-crtE-conA à INT1 3'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>Apprêt FW pour la vérification de l'intégration de conB-crtYB-conC à INT2 5'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGATTGGTCC</td>
			<td>Apprêt FW pour la vérification de l'intégration de conB-crtYB-conC à INT2 3'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>Apprêt FW pour la vérification de l'intégration de conD-crtI-conE à INT3 5'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>Apprêt FW pour la vérification de l'intégration de conD-crtI-conE à INT3 3'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC</td>
			<td>Amorce DE RV pour la vérification de l'intégration de con5-crtE-conA à INT1 5'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>Amorce DE RV pour la vérification de l'intégration de con5-crtE-conA à INT1 3'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>Amorce de RV pour la vérification de l'intégration du conB-crtYB-conC à l'INT2 5'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAGTCTG</td>
			<td>Amorce de RV pour la vérification de l'intégration du conB-crtYB-conC à l'INT2 3'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>Amorce DE RV pour la vérification de l'intégration du conD-crtI-conE à l'INT3 5'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>Amorce DE RV pour la vérification de l'intégration du conD-crtI-conE à inT3 3'</td>
			<td>7,4,1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. Les séquences audacieuses dénotent les séquences de connecteurs. b. Les amorces avant et arrière sont désignées comme FW et RV, respectivement.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tableau supplémentaire 2 : Séquences d'apprêt.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Tableau supplémentaire 3 : Conception des souches construites.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Tableau supplémentaire 4 : Séquences de cassettes d'expression d'ADN des donneurs et régions écaillantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le système CRISPR/Cas12a, combiné à un seul réseau de crRNA, permet une édition multiplexe efficace du génome de S. cerevisiae à plusieurs loci simultanément. Ceci est démontré par la construction de caroténoïdes produisant des souches de levure qui sont ensuite utilisés pour créer de l'art pixel levure.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Ce protocole démontre une nouvelle méthode pour l’édition du génome multiplexe de Saccharomyces cerevisiae en introduisant des cassettes d’expression multiples sur différents locus en une seule étape de transformation. Cette approche d’assemblage plasmide libre de clonage pour exprimer un seul tableau de crRNA, mène à un protocole rapide, efficace, et flexible d’édition de génome. Nous allons concevoir des cellules de levure de type sauvage, pour produire des caroténoïdes en introduisant des gènes héterologeux gratuits sur les loci génomiques libres.Le tableau crRNA unique est composé de crARN individuels libres exprimés à partir de promoteur libre de polymésase d’ARN. Cas12a traite in vivo le tableau crRNA en crARN individuels. Les crARN guident Cas12a vers le loci cible sur l’ADN génomique où Cas12a introduit des ruptures de double brin.Les fragments d’ADN vers le bas se recombinent pour la recombinaison in vivo et s’intègrent dans l’ADN génomique. Klaudia Ciurkot, doctorante, démontrera le protocole. Jeffery van Wijk, scientifique associé.Et Brenda Vonk, scientifique associée principale de notre laboratoire. Après avoir obtenu un seul tableau crRNA pour les expériences d’édition du génome multiplex de l’ADN synthétique, préparer le mélange d’amplification PCR, et charger le tableau dans le thermocycleur pour l’amplification. Pour analyser les produits PCR par électrophorèse, exécutez les échantillons sur un gel agarose de 0,8 % à 5 V/cm pendant 40 minutes.Chargez l’échelle d’ADN avec les fragments d’ADN allant de 100 10000 paires de base Puis purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Pour la transformation de levure, commencez par pré-culture de levure de type sauvage dans un flacon de 100 mL contenant 20 mL d’extrait de levure peptone dextrose ou YEPD moyen. Pour une incubation d’une nuit, à 30 degrés Celsius, et 250 rotations par minute Le lendemain matin, inoculer 20 mL de milieu frais YEPD avec un volume calculé de levure pré-culture pendant la nuit.Placez la culture dans un incubateur secouant jusqu’à ce qu’une densité optique de 1,0, mesurée à 600 nanomètres soit atteinte. Récolter les cellules de levure par centrifugation. Lavez la pastille de cellules de levure dans 20 mL d’eau déminéralisée à température ambiante, suivie d’une centrifugation supplémentaire.Resuspendez la pastille dans 100 microlitres de solution tris-EDTA d’acétate de lithium, et transférez la levure dans un tube de microcentrifugeuse. Mélanger cinq microlitres d’ADN porteur à brin unique et un microgramme de pCSN067 plasmide avec la suspension des cellules de levure. Mélangez ensuite 600 microlitres de solution LiAc-TE de polyéthylène glycol avec l’échantillon.Incuber les cellules de levure et le plasmide pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius et 450 prm dans un bloc thermique supérieur à la table. À la fin de l’incubation, mélanger 70 mL de sulfure de diméthyle avec la solution de transformation. Chauffer le mélange pendant 15 minutes dans un bain d’eau de 42 degrés Celsius.Transférer le mélange dans un tube de fond rond de 15 mL. Ajouter 10 mL de YEPD au tube pour une incubation d’une nuit à 30 degrés Celsius et 250 rpm. Le lendemain matin, recueillir les cellules transformées par centrifugation, et aspirer tous sauf les 200 derniers microlitres du supernatant.Resuspendez la pastille de cellules de levure transformée dans le supernatant restant. Plaque 150 microlitres du mélange de transformation, et 150 microlitres d’une dilution 20 fois des 50 microlitres restants de mélange de transformation dans YEPD, sur des plaques d’agar YEPD, complétées par 0,2 grammes par litre de G418. Après 48 à 72 heures à 30 degrés Celsius, choisissez un seul transformateur pour resserrage sur une nouvelle plaque d’agar YEPD complétée par 0,2 g/L de G418.Pour la deuxième transformation, faire croître la culture à une densité optique à 600 nanomètres de 1,0, comme nous venons de le démontrer. Et ajouter 20 microlitres de cellules à un tube de microcentrifugeuse. Après centrifugation, resuspendez la pastille cellulaire dans 100 microlitres de la solution LiAc-TE, et ajoutez ssDNA.Dans un tube séparé, combinez un microgramme du tableau unique de crRNA, un microgramme du plasmide destinataire linéarisé pour le tableau de crRNA, un microgramme de chaque ADN de donateur, et un microgramme de chaque région de flanc. Puis transférer le mélange d’ADN dans le tube de cellules de levure compétentes et compléter la deuxième transformation comme démontré pour la première transformation. Le lendemain matin, recueillir les cellules par centrifugation et réutiliser la pastille dans un petit aliquot de supernatant.Puis plaque 150 microlitres du mélange de transformation, et 150 microlitres d’une dilution 20 fois du mélange de transformation dans le milieu YEPD, sur des plaques d’agar YEPD complétées par 0,2 g/L G418, et 0,2 g/L de nourseothricin Après 48 à 72 heures, à 30 degrés Celsius, choisissez un seul transformateur coloré pour le resserrage sur une nouvelle plaque YEPD pour obtenir une seule colonies colorées. Pour déterminer l’efficacité de l’édition du génome, comptez le nombre de colonies colorées et blanches sur les plaques de transformation et divisez le nombre de colonies colorées par le nombre total de colonies. Pour créer l’art pixel de levure, inoculer des flacons individuels de secousse de 500 mL contenant 100 mL de milieu YEPD avec trois caroténoïdes de couleur différente produisant des souches de S.cerevisiae, et un type sauvage CEN.Souche PK113-7D. Incuber les cultures pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec des secousses à 250 rpm. Transférer 0,5 mL de chaque culture nocturne vers des tubes individuels contenant 0,5 mL de gradient de densité stérile et non ionique moyen par tube, et mélanger brièvement les solutions par vortex.Transférer les suspensions cellulaires dans un réservoir individuel qualifié 2 par 3 puits. Utilisez un fichier csv avec le réglage d’étalonnage des fluides 6RES_AQ_GPSA2 sur un instrument acoustique de manutention de liquide pour repérer 25 nanolitres de chaque souche S.cerevisiae de la plaque source de réservoir qualifiée appropriée sur une microplaque de destination de puits 6144 contenant 50 mL d’agar YEPD. Lorsque tous les puits ont été repérés, incuber la microplaque à 30 dégressivité Celsius pendant 48 heures.Pour intensifier les couleurs des souches, conserver les plaques d’agar à 4 degrés Celsius pendant au moins 72 heures. Une photo de Rosalind Franklin est apparue dans l’assiette. Comme démontré, promoteur, cadre de lecture ouvert, terminator, et deux séquences contiguës connecteur de 50 bp peuvent être assemblés dans une cassette d’expression via une réaction de clonage Golden Gate, et vérifié par PCR.Après amplification du tableau de crRNA simple par PCR, le plasmide destinataire pour le tableau unique de crRNA est linéarisé comme confirmé par l’électrophoresis. L’efficacité de l’édition du génome multiplexe peut être calculée par le pourcentage de colonies colorées après la transformation, et par les résultats des analyses PCR qui confirment l’intégration de l’ADN des donneurs aux emplacements prévus de l’ADN génomique. Par exemple, à partir d’une image en noir et blanc de Rosalind Franklin, une liste de quatre couleurs et de repérage a été créé qui a ensuite été utilisé pour repérer les quatre souches de levure différentes sur une microplaque d’agar par l’intermédiaire d’un gestionnaire de liquide acoustique, comme démontré, résultant en une peinture à haute résolution de levure du scientifique.Pour cette transformation, utilisez des solutions fraîchement préparées et des fragments d’ADN de haute qualité. Cette méthode peut également être appliquée pour l’introduction multiplexe de suppressions définies et de mutations ponctuelles dans l’ADN génomique. En outre, des expériences de régulation CRISPR peuvent être réalisées.Cette méthode peut être modifiée pour introduire plus de crARN gratuits dans un tableau afin d’augmenter le nombre de modifications simultanées qui peuvent être apportées.

crisprcas12a-multiplex-genome-editing-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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