Name: Un petit ARN non codant MicC contribue à la virulence des protéines de la membrane externe chez Salmonella enteritidis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Découvrez la création de mutants de délétion du petit ARN micC chez Salmonella enteritidis par recombinaison homologue assistée. Cette méthode simplifie l'inactivation génique pour l'étude de la virulence et le développement vaccinal.

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Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale chinoise des sciences (n° 31972651 et 31101826), de la Fondation scientifique du lycée du Jiangsu (n ° 14KJB230002), du Laboratoire clé d’État de biotechnologie vétérinaire (n ° SKLVBF201509), de la subvention de la Fondation des sciences de la nature de Yangzhou (n ° YZ2014019), un projet financé par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD).

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches. Le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou a approuvé toutes les expériences et procédures appliquées aux animaux (SYXK2016-0020).
1. Souches bactériennes, plasmides et conditions de culture
<ol><li>Utilisez les bactéries et les plasmides énumérés dans le tableau 1.</li>
	<li>Culture de bactéries dans un bouillon LB ou sur des plaques de gélose LB à 37 °C, en présence de 50 μg/mL d’ampicilline (Amp), le cas échéant.</li>
	<li>Des souches de culture contenant des plasmides sensibles à la température sont utilisées pour la construction de mutants de délétion à 30 °C.</li>
</ol>2. Cloner le gène micC de S. Souche 50336 d’Enteritidis
<ol><li>Basé sur la séquence amont et aval du gène micC de S. La souche SL1344 de Typhimurium conçoit les amorces vmicC-F et vmicC-R pour amplifier un fragment contenant le gène micC par PCR en utilisant l’ADN génomique SE50336 comme modèle.</li>
	<li>Mélanger 5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces vmicC-F et vmicC-R, respectivement, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble pour la PCR.</li>
	<li>Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Séquencer le produit PCR pour obtenir la séquence du gène micC .</li>
</ol>3. Construction du mutant de délétion micC
NOTA : Le mutant micC-négatif de la souche 50336 de Salmonella Enteritidis a été construit en utilisant la recombinaison médiée par λ-Red comme décrit précédemment13,14. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 2.
<ol><li>Amplifier la cassette de chloramphénicol contenant des fragments d’homologie du gène micC .<ol><li>Concevoir des amorces micC-F et micC-R pour amplifier la cassette de chloramphénicol (Cm) à partir du plasmide pKD3, y compris des extensions d’homologie de 50 pb à partir des 5' et 3' du gène micC .</li>
		<li>Extrayez le plasmide pKD3 comme modèle de PCR.</li>
		<li>Mélanger 5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces micC-F et micC-R, respectivement, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble comme mélange réactionnel PCR</li>
		<li>Amplifier la cassette Cm avec les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 1 min, 52 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 10 cycles; 94 °C pendant 1 min, 63 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Détecter la taille du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Purifier et récupérer le produit PCR avec le kit de récupération de gel d’ADN, et déterminer la concentration d’ADN par spectrophotomètre. ATTENTION : La PCR doit être réalisée deux fois. Le premier produit de PCR a été dilué dans un rapport de 1:200 et utilisé comme matrice pour la PCR secondaire, afin d’éliminer l’interférence d’une recombinaison ultérieure par le plasmide pKD3.</li>
	</ol></li>
	<li>Construire la 1èresouche recombinante 50336ΔmicC::cat
	<ol><li>Mélanger uniformément 100 μL de cellules compétentes SE50336 avec 5 μL de plasmide pKD46 et incuber sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique du mélange ci-dessus à 42 °C pendant 90 s et transfert rapide du mélange dans la glace pendant 2 min pour transformer le plasmide pKD46 en SE50336. Cribler les colonies positives en les cultivant pendant la nuit à 30 °C sur une plaque résistante à l’ampère (50 μg/mL).</li>
		<li>Ajouter 30 mM de L-arabinose à la culture liquide SE50336/pKD46 et induire l’expression de la recombinase par une culture d’agitation à 30 °C pendant 1 h. Ensuite, préparez les cellules compétentes.</li>
		<li>Mélanger 100 ng de produit PCR purifié (étape 3.1) et 40 μL de cellules compétentes SE50336/pKD46 dans une coupelle à chocs électriques (p. ex., Bio-Rad). Effectuer la transformation des chocs électriques avec les paramètres de tension 1,8 kV, impulsion 25 μF et résistance 200 Ω.</li>
		<li>Après électrotransformation, transférer le mélange dans 1 mL de milieu SOC et une culture d’agitation à 150 rpm et 30 °C pendant 1 h. Ensuite, étaler le mélange sur une plaque LB résistante à Cm (34 μg/mL) et la cultiver à 37 °C pendant la nuit pour dépister la colonie positive.</li>
		<li>Culture de la colonie positive ci-dessus à 42 °C pendant 2 h. Cribler la colonie sensible à l’Amp (50 μg/mL) mais résistante au Cm (34 μg/mL) à 37 °C pendant la nuit pour obtenir la 1ère souche recombinante sans pKD46.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifier la 1ère souche recombinante 50336ΔmicC::Cat.<ol><li>Extraire l’ADN génomique 50336ΔmicC::Cat comme modèle de PCR. Utiliser les mêmes composants de réaction PCR qu’à l’étape 2.1. Effectuer la réaction PCR dans les mêmes conditions qu’à l’étape 2.1.</li>
		<li>Détecter la taille du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose et séquencer le produit PCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Construire le mutant de suppression 50336ΔmicC.
	<ol><li>Électroporate 100 ng de plasmide pCP20 dans 40 μL de cellules compétentes 50336ΔmicC::Cat avec les paramètres de tension 1,8 kV, impulsion 25 μF et résistance 200 Ω, transformants positifs sur écran sur plaque résistante à l’amplificateur (50 μg/mL) et au Cm (34 μg/mL) à 30 °C.</li>
		<li>Transférer au-dessus des transformants positifs en LB non résistants et les cultiver pendant une nuit à 42 °C, puis isoler les colonies individuelles sur une plaque LB à 37 °C. Sélectionnez la colonie sensible à la fois à Amp et à Cm. Ce mutant est le mutant de délétion micC SE50336ΔmicC.</li>
		<li>Vérifiez 50336ΔmicC par PCR.<ol><li>Extraire l’ADN génomiquemicC 50336Δ comme modèle de PCR. Mélanger 5 μLof 10x tampon réactionnel PCR, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorce vmicC-F, 1 μL d’amorce vmicC-R, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble pour la PCR.</li>
			<li>Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10min.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Construction de la souche complétée par le micC
<ol><li>Concevoir des amorces pBR-micC-F et pBR-micC-R avec des sites de restriction NheI et SalI.<ol><li>Amplifier le gène micC pleine longueur avec des séquences de flanc en utilisant un mélange réactionnel PCR contenant 5 μL d’ADN génomique SE50336 comme matrice, des amorces 1 μL de pBR-micC-F et 1 μL de pBR-micC-R comme amorces, 5 μL de tampon de réaction PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM) et 35 μL de ddH2O.</li>
		<li>Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 50 s, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles et extension à 72 °C pendant 10 min. Purifier et récupérer le produit PCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Digérer le produit PCR et le plasmide pBR322 respectivement en utilisant l’enzyme de restriction NheI et SalI, et les ligaturer en utilisant la T4 ligase à 16 °C pendant la nuit pour obtenir le plasmide pBR322-micC.</li>
	<li>Transformer pBR322-micC en cellules compétentes SE50336ΔmicC et cribler le transformant positif pour obtenir la souche complémentaire SE50336ΔmicC/pmicC. Extraire le plasmide pBR322-micC de la souche complétée et le vérifier par digestion et séquençage des enzymes de restriction.</li>
</ol>5. Isolement de l’ARN et PCR quantitative en temps réel
<ol><li>Culture SE50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/pmicC en milieu LB pendant une nuit à 24 °C avec culture sous agitation de 180 rpm jusqu’à une DO600 de 2,0. Recueillir la culture bactérienne par centrifugation à 13000 rpm pendant 2 min.</li>
	<li>Extraire l’ARN total à l’aide du réactif TRIzol. Incuber 50 μL d’ARN isolé avec 2 μL de DNaseI et 6 μL de tampon 10x à 37 °C pendant 30 min pour éliminer l’ADN. Déterminer la quantité d’ARN en pipetant 1 μL d’échantillon d’ARN vers un micro-spectrophotomètre.</li>
	<li>Synthèse de l’ADNc<ol><li>Utiliser 1 μg d’ARN total pour la synthèse de l’ADNc dans 20 μL de système de réaction de transcription inverse (4 μL de tampon 5x, 1 μL de mélange d’enzymes RT, 1 μL de mélange d’amorces RT, 10 μL d’ARN total et 4 μL deddH2O). Incuber au-dessus du système réactionnel à 37 °C pendant 15 min, puis à 85 °C pendant 5 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Concevoir des amorces basées sur la séquence des gènes cibles ompA, ompC et ompD. Effectuez une PCR de transcription inverse à l’aide d’un kit de réactif RT. Les composants de réaction PCR contiennent 2,5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 1 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces du gène cible (ompA, ompC ou ompD), 2,5 μL de matrice, 0,5 μL d’ADN polymérase Taq et 17,5 μL de ddH2O.<ol><li>Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10min.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez une PCR en temps réel à l’aide du kit RT-PCR vert SYBR dans un instrument RT-PCT en trois exemplaires.<ol><li>Utilisez les composants de réaction PCR suivants : 10 μL de tampon SYBR 2x, 0,4 μLof d’amorce directe et d’amorce inverse respectivement, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μLd d’ADNc et 6,8 μL de H2O libre de RNase.</li>
		<li>Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 95 °C pendant 1 min pendant un cycle; 95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 34 s pendant 40 cycles.</li>
		<li>Normaliser toutes les données du gène de référence endogène gyrA. Utiliser la méthode 2-Δ ΔCT pour la quantification des données15.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Tests de virulence
<ol><li>Culture SE50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/pmicC en phase stationnaire LB moyenne à précoce (OD600 de 2-3) à 24 °C, récolte par centrifugation et dilution à l’UFC appropriée mL-1 dans du PBS stérile.</li>
	<li>Pour les infections chez les souris, diluer les souches cultivées à 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL et 103 UFC/200 μL en suspension. Infecter des groupes de cinq souris Balb/c âgées de 6 à 8 semaines par souche par injection sous-cutanée. Injectez au groupe témoin 200 μL de solution saline physiologique.</li>
	<li>Pour les infections chez le poulet, diluer au-dessus de trois souches à 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL et 109 UFC/200 μL en suspension. Infecter des groupes de vingt poulets âgés de 1 jour par souche par injection sous-cutanée.</li>
	<li>Surveiller quotidiennement les signes de maladie et de décès d’animaux de laboratoire. Calculer la DL50 (dose létale médiane) 14 jours après l’infection comme décrit précédemment16. Traiter les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.</li>
	<li>Dans les groupes infectés, prélever le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins des poussins fraîchement morts. Pesez 0,5 g des tissus ci-dessus séparément et broyez-les avec une opération stérile. Diluer progressivement les échantillons, les étaler sur une plaque LB et les cultiver pendant 8-10 h à 37 °C. Noter la quantité de souches de Salmonella colonisées dans les tissus des poussins.</li>
</ol>

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<li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li>
<li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li>
<li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboregulation+in+Escherichia+coli%3A+DsrA+RNA+acts+by+RNA%3ARNA+interactions+at+multiple+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li>
<li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C%2FA-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li>
<li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li>
<li>Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L. Enteritidis est un important agent pathogène intracellulaire facultatif qui peut infecter les jeunes poulets et produire des symptômes allant de l’entérite à l’infection systémique et à la mort17,18. De plus, S. Enteritidis provoque des infections latentes chez les poulets adultes et les porteurs chroniques contaminent les produits avicoles, ce qui entraîne des infections d’origine alimentaire chez les humains19. Le mé...

Les petits ARN non codants (ARNs) ont une longueur de 40 à 400 nucléotides, qui ne codent généralement pas pour des protéines mais pourraient être transcrits indépendamment dans les chromosomes bactériens 1,2,3. La plupart des ARNs sont codés dans les régions intergéniques (IGR) entre les régions codant pour les gènes et interagissent avec les ARNm cibles par des actions d’appariement de bases, et régulent l’expression des gènes cibles au niveau post-transcriptionnel 4,5. Ils jouent un rôle régulateur important dans le métabolisme des substances, la synthèse des protéines de la membrane externe, la détection du quorum et l’expression des gènes de virulence5.
MicC est un petit transcrit d’ARN de 109 nucléotides présent dans Escherichia coli et Salmonella enterica sérovar Typhimurium, qui pourrait réguler l’expression de plusieurs protéines de la membrane externe telles que OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 et Omp36 6,7,8,9. MicC régule l’expression de l’OmpC en inhibant la liaison du ribosome au leader de l’ARNm ompC in vitro et nécessite le chaperon d’ARN Hfq pour sa fonction chez Escherichia coli6. Chez Salmonella Typhimurium, MicC réduit au silence l’ARNm ompD via un duplex d’ARN ≤12-bp dans la séquence codante (codons 23-26) puis déstabilise l’ARNm endonucléolytique7. Ce processus de régulation est assisté par la protéine chaperonne Hfq10. L’OmpC est une protéine membranaire externe abondante que l’on croyait importante dans les environnements où les concentrations de nutriments et de toxines étaient élevées, comme dans l’intestin6. La porine OmpD est la protéine membranaire externe la plus abondante chez Salmonella Typhimurium et représente environ 1% de la protéine cellulaire totale11. L’OmpD est impliqué dans l’adhérence aux macrophages humains et aux cellules épithéliales intestinales12. MicC réprime également l’expression des porines OmpC et OmpD. On pense que MicC peut réguler la virulence. Pour explorer de nouveaux gènes cibles régulés par MicC et étudier la fonction de régulation de la virulence de micC, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis (SE), puis construit le mutant 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/p micC. De nouveaux gènes cibles ont été criblés par qRT-PCR. La virulence de 50336ΔmicC a été détectée par des souris et des infections de poulet.

<table><tbody><tr><td>dextrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610219</td><td>pour la préparation du bouillon</td></tr><tr><td>Kit de purification de l’ADN</td><td>TIANGEN</td><td>DP214</td><td>pour la purification de l’ADN</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR01A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Réactif chimique</td><td>10017608</td><td>pour la préparation du bouillon</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sinopharm Réactif</td> chimique <td>20032116</td><td>pour la préparation du bouillon</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610071</td><td>&lambda ;-Red recombination</td></tr><tr><td>Mini Plasmide</td><td>Kit TIANGEN</td><td>DP106</td> extraction <td>du plasmide</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Réactif chimique</td><td>10019308</td><td>pour la préparation du bouillon</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sinopharm Réactif</td><td>chimique 10002917</td><td>pour la préparation du bouillon</td></tr><tr><td>PrimeScriptRRT Kit de réactifs avec gomme d’ADNg&nbsp ;</td><td>TaKaRa</td><td>RR047</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBRR Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>Ligation</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>pour la préparation du bouillon</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>pour la préparation du bouillon</td></tr><tr><td>centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>Centrifugation Appareil d’électrophorèse</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Électrophorèse</td></tr><tr><td>&nbsp ; Système d’électroporation</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td>pour la transformation bactérienne</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>BioTek</td><td>Détection de</td><td>l’absorbance</td></tr><tr><td>d’époque Système PCR en temps réel</td><td>Système Applied Biosystems</td><td>7500</td><td>qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

un petit arn non codant micc contribue à la virulence des protéines de la membrane externe chez salmonella enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Un petit ARN non codant (ARNs) est un nouveau facteur pour réguler l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Une sorte d’ARNs MicC, connu chez Escherichia coli et Salmonella Typhimurium, pourrait réprimer l’expression des protéines de la membrane externe. Pour étudier plus avant la fonction de régulation du micC chez Salmonella Enteritidis, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis, puis construit le mutant 50336Δ micC par le système de recombinaison à base de λ Red et le mutant 50336Δ micC/p micC complété portant le plasmide recombinant pBR322 exprimant micC. Les résultats de la qRT-PCR ont démontré que la transcription de l’ompD dans 50336Δ micC était 1,3 fois plus élevée que celle de la souche de type sauvage, tandis que la transcription de ompA et ompC dans 50336ΔmicC était 2,2 fois et 3 fois plus élevée que celles de la souche de type sauvage. Ceux-ci indiquent que micC réprime l’expression de ompA et ompC. Dans l’étude suivante, la pathogénicité de 50336ΔmicC a été détectée par des souris Balb/c âgées de 6 semaines et des poulets âgés de 1 jour. Le résultat a montré que la DL50 de la souche de type sauvage 50336, les mutants 50336Δ micC et 50336Δ micC/p micC pour les souris Balb/c âgées de 6 semaines étaient respectivement de 12,59UFC, 5,01 UFC et 19,95 UFC. La DL 50 des souches pour les poulets âgés de 1 jour était de 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC et2,54 x 10 8 UFC, respectivement. Il a indiqué que la délétion de micC améliorait la virulence de S. Enteritidis chez la souris et le poulet en régulant l’expression des protéines de la membrane externe.

Construction du micC mutant 50336Δ et de la souche 50336Δ micC /p micC Le résultat du clone du gène micC indiquait que ce gène était composé de 109 pb montrant une identité de 100% avec celle de S. Typhimurium. Sur la base des données de séquence, le mutant de délétion 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/pmicC ont été cons...

Un système de recombinaison médiée par λ-Red a été utilisé pour créer un mutant de délétion d’un petit micC à ARN non codant.

Un petit ARN non codant MicC contribue à la virulence des protéines de la membrane externe chez Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Ce protocole peut être utilisé pour inactiver les gènes chromosomiques afin d’isoler les mutants pour l’étude de la fonction des gènes et des bactéries. Il rend le processus de recombinaison homologue simple, rapide et très efficace. En utilisant cette technique, les gènes liés à la virulence de l’agent pathogène peuvent être supprimés pour obtenir le mutant atténué qui peut être utilisé comme candidat pour le vaccin atténué.Commencez par amplifier la cassette de chloramphénicol contenant des fragments hémologiques du gène micC. Concevoir des amorces avant et arrière pour amplifier la cassette de chloramphénicol à partir du plasmide PKD3, y compris 50 extensions d’homologie de paires de bases des cinq extrémités premières et des trois extrémités premières du gène micC. Effectuer la PCR comme décrit dans le manuscrit en utilisant le plasmide PKD3 comme modèle pour amplifier la cassette de chloramphénicol.Déterminer la taille du produit PCR avec électrophorèse sur gel d’agarose. Purifiez ensuite le produit avec un kit de récupération de gel d’ADN et déterminez la concentration d’ADN par spectrophotométrie. Effectuer une deuxième réaction PCR pour éliminer l’interférence d’une recombinaison ultérieure par le plasmide PKD3.Diluez le premier produit de PCR dans un rapport de 1 à 200 et utilisez-le comme modèle pour la PCR secondaire. Pour construire la première souche recombinante 50336 delta micC dot cat, mélanger 100 microlitres de cellules compétentes SE 50336 avec cinq microlitres de plasmide PKD 46 et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Choquer le mélange à 42 degrés Celsius pendant 90 secondes et le transférer rapidement sur la glace pendant deux minutes pour transformer le plasmide en cellules.Dépistage des colonies positives en cultivant les cellules pendant la nuit à 30 degrés Celsius sur une plaque résistante à l’ampicilline. Le lendemain, ajoutez 30 milli de L arabinose supplémentaire à la culture liquide SE 50336 PKD 46 et induisez l’expression de la recombinase avec une incubation d’une heure à 30 degrés Celsius tout en agitant. Mélanger 100 nanogrammes du produit PCR purifié et 40 microlitres de cellules compétentes SE 50336 PKD 46 dans une coupelle à choc électrique.Ensuite, effectuez la transformation par choc électrique. Après électrotransformation, transférer le mélange dans un millilitre de milieu SOC et un incubateur de culture à agitation à 150 tr / min et 30 degrés Celsius pendant une heure. Étaler le mélange sur une plaque LB résistante au chloramphénicol et la cultiver à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour dépister les colonies positives.Culture des colonies positives à 42 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, la colonie a examiné la sensibilité à l’ampicilline et la résistance au chloramphénicol à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour obtenir la première souche recombinante sans PKD 46. Après avoir extrait l’ADN génomique du chat point 50336 Delta micC par PCR et électrophorèse sur gel, électroplaque 100 nanogrammes de plasmide PCP 20 dans 40 microlitres de cellules compétentes 50336 Delta micC point cat.Criblez les transformants positifs sur des plaques résistantes à l’ampicilline et au chloramphénicol à 30 degrés Celsius. Transférer les transformants positifs dans un milieu liquide LB non résistant et les cultiver pendant la nuit à 42 degrés Celsius. Ensuite, isolez les colonies individuelles sur une plaque LB à 37 degrés Celsius.Sélectionnez la colonie sensible à l’ampicilline et au chloramphénicol. Ce mutant est le mutant de délétion micC SE 50336 Delta micC. Vérifiez 50336 Delta micC en effectuant une PCR comme décrit dans le manuscrit texte.Ce protocole a été utilisé pour construire le mutant de délétion 50336 Delta micC dans le mutant 50336 Delta micC complimenté, pmicC. Le premier chat recombinant 50336 Delta micC point cat a été validé par PCR avec une taille de bande attendue d’environ 1200 paires de bases de produits PCR avec l’insertion de chloramphénicol contre 279 paires de bases dans la souche de type sauvage. Dans la deuxième recombinaison, la cassette de chloramphénicol a été éliminée par PCP 20.Les résultats de la PCR combinés au séquençage ont confirmé que le mutant micC isogénique a été construit avec succès. L’expression des gènes ompA, ompC et ompD dans les souches 50336, 50336 Delta micC et 50336 delta micC pmicC a été analysée par PCR quantitative en temps réel. La transcription de ompA et ompC et 50336 delta micC a augmenté d’environ 2,2 fois et triplé par rapport à la souche de type sauvage.Alors que la transcription de ompD n’a augmenté que légèrement. Les tests DL 50 ont montré qu’après avoir infecté des souris BALB / c âgées de six à huit semaines avec chacune des trois souches, la plupart des souris infectées par 50336 Delta micC présentaient une lassitude, une inappétence ou une diarrhée 48 heures après l’infection et mouraient après 96 heures. Les souris infectées par la souche de type sauvage et 50336 delta micC pmicC ont présenté les mêmes symptômes 72 heures après l’infection et sont mortes après 120 heures.Les DL 50 des trois souches ont indiqué que la virulence du mutant 50336 Delta micC était multipliée par 2,5 par rapport au type sauvage. Cette technique aide les chercheurs à étudier la fonction des gènes bactériens et à obtenir la souche modifiée souhaitée en supprimant les gènes cibles.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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