Name: Analyse phénotypique semi-automatisée de cultures fonctionnelles de cellules sphéroïdes 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Découvrez l'analyse protéomique de sphéroïdes 3D cultivés en bioréacteur avec LC-MS. Cette méthode permet de caractériser des centaines de réplicats biologiques simultanément pour étudier la fonction hépatique.

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Le laboratoire de Sidoli tient à remercier la Fondation pour la recherche sur la leucémie (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), l’AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck et le bureau du directeur des NIH (1S10OD030286-01).

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</ol>

Helle Sedighi Frandsen est employée comme chercheuse scientifique chez CelVivo ApS, le producteur du système ClinoStar. Karoline Mikkelsen est une doctorante industrielle employée chez CelVivo ApS et effectuant ses études doctorales à la SDU, à Odense, au Danemark. Tous les autres auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Comprendre la biologie derrière les structures cellulaires tridimensionnelles (3D) est extrêmement important pour une connaissance plus complète de leurs fonctionnalités. L’utilisation de modèles 3D pour l’étude de la biologie complexe et le dépistage de la toxicité suscite un intérêt croissant. Lors de la culture de cellules en 3D, de nombreux facteurs doivent être pris en compte, y compris l’évaluation phénotypique du système modèle. Un phénotype est défini comme un groupe de caractéristiques observables d’un organisme spécifique, telles que la morphologie, le comportement, les propriétés physiologiques et biochimiques20.
Dans ce protocole, nous démontrons comment des expériences de protéomique peuvent être menées à partir de quelques sphéroïdes et peuvent être utilisées pour surveiller le phénotype typique du foie. La spectrométrie de masse est devenue une méthode largement appliquée pour la caractérisation cellulaire 3D, permettant l’étude d’une variété de questions biologiques 12,16,21,22. Pour une analyse complète du protéome, il est recommandé d’utiliser au moins 20 μg de matière première protéique, à partir de laquelle 1 μg est injecté dans le spectromètre de masse. Il est important de mentionner que l’ajout de moins d’échantillon peut entraîner une perte de sensibilité, et que l’ajout d’un échantillon supplémentaire détériorerait progressivement la qualité de la chromatographie et finirait par entraîner le blocage de la colonne. Dans cette étude, nous avons montré que les sphéroïdes HepG2/C3A et THLE-3 sont enrichis en protéines importantes provenant de la glycolyse et du cycle du TCA, qui sont des voies hépatiques spécifiques et sont essentielles au maintien de la glycémie et à la production d’énergie23,24. En fait, l’analyse par spectrométrie de masse fournit non seulement des informations au niveau des protéines, mais permet également d’étudier les modifications post-traductionnelles des protéines, comme l’a montré précédemment notre groupe16.
Un autre aspect à prendre en compte dans les études phénotypiques 3D est le nombre et la taille des sphéroïdes. En plus de rendre les expériences plus reproductibles, il est essentiel de compter le nombre de sphéroïdes et de déterminer leur taille pour déterminer quand diviser la culture en plusieurs bioréacteurs, car le nombre de structures 3D dans un récipient peut avoir un impact sur la taille des sphéroïdes et les niveaux d’activité métabolique. Cependant, il est important de souligner que le nombre et la taille des sphéroïdes dépendent de la lignée cellulaire, du nombre de cellules de départ, du processus de division et du moment de la collecte. Des détails sur la culture sphéroïdale de l’HepG2/C3A, tels que le nombre de cellules par sphéroïde, la teneur en protéines et la taille en fonction de l’âge, ont été fournis par Fey, Korzeniowska et Wrzesinski25. Pour une analyse précise et réussie à l’aide de la méthode semi-automatisée décrite ici, l’étape la plus critique est une bonne image des sphéroïdes. Pour simplifier, la photo peut être prise avec un téléphone ou une tablette, mais sa résolution doit être maintenue aussi élevée que possible. Comme les images sont rapides à acquérir, elles permettent des expériences de dépistage à grande échelle pour visualiser des caractéristiques phénotypiques spécifiques ou étudier les réponses au traitement médicamenteux. Par conséquent, en raison du nombre croissant de tests cellulaires, un certain nombre de logiciels open source ont été développés au cours des 10 dernières années pour l’analyse d’images26. Dans ce protocole, nous décrivons un système semi-automatisé utilisant le logiciel FIJI18 pour compter et mesurer la taille des sphéroïdes. Nous avons présenté des scripts (commandes de programmation simples) pour définir une séquence d’opérations algorithmiques qui peuvent être appliquées à une collection d’images, ce qui rend l’analyse facile et rapide. Cependant, en fonction des caractéristiques du sphéroïde, une mesure manuelle doit être utilisée. Par exemple, si les sphéroïdes sont trop translucides, l’écriture FIDJI sera imprécise. D’ailleurs, l’un des critères les plus importants pour que cette méthode fonctionne est la compacité des sphéroïdes. Cette caractéristique contribuera à un contraste de couleur plus élevé entre les sphéroïdes et l’arrière-plan, ce qui est nécessaire pour que la méthode soit précise.
En résumé, outre la présentation d’une méthodologie de culture de sphéroïdes hautement reproductibles, un système semi-automatisé couplé à une caractérisation phénotypique via la capture d’images et la protéomique a également été décrit. Nous nous attendons à ce que cette boîte à outils pour l’analyse des cellules 3D devienne plus robuste avec un logiciel d’analyse d’images entièrement automatisé et des spectromètres de masse de nouvelle génération.

Les cultures cellulaires in vitro se sont avérées nécessaires et inestimables pour établir des connaissances fondamentales en biologie. Une grande partie de la compréhension scientifique en biologie et en cancer en particulier provient du système de culture 2D, c’est-à-dire des cellules qui se développent dans une monocouche. Bien que la culture 2D ait été le système de culture cellulaire dominant, elle présente de nombreux inconvénients qui peuvent potentiellement étouffer les progrès biologiques. Par exemple, les cultures 2D manquent d’interactions cellule-cellule importantes pour la signalisation cellulaire et la prolifération1. À ce jour, il a été démontré que les systèmes de culture 3D modélisent mieux la différenciation, la réponse aux médicaments, l’invasion tumorale et la biologie 2,3,4,5. La modélisation 3D des cancers malins est particulièrement vitale en raison de l’augmentation du vieillissement de la population et de la mortalité par cancer. Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l’une des principales causes de mortalité liée au cancer dans le monde et a souvent un pronostic catastrophique6. Le CHC est connu pour avoir un faible taux de guérison, une faible réponse aux médicaments et un taux élevé de récurrence 6,7,8. Plusieurs modèles 3D pour le foie normal et le CHC ont été développés qui imitent la physiologie du tissu hépatique normal et malin in in vivo 9,10.
Certains des systèmes 3D actuels comprennent des revêtements liquides, des bioréacteurs, de l’hydrogel, des échafaudages et des structures imprimées en 3D. Les sphéroïdes générés dans les bioréacteurs offrent des avantages uniques car ils imitent la distribution tumorale de l’exposition aux nutriments, des échanges gazeux et de la prolifération/quiescence cellulaire11. Les bioréacteurs sont particulièrement adaptés aux modèles de cancer en raison de leur facilité d’utilisation, de leur grande évolutivité, de la diffusion des nutriments et de leur accessibilité11. De plus, les bioréacteurs peuvent permettre des expériences à haut débit, une plus grande reproductibilité et une diminution des erreurs humaines. Le bioréacteur utilisé dans cette étude est unique parce qu’il simule un système de gravité réduite, ce qui minimise les forces de cisaillement perturbatrices appliquées dans les bioréacteurs typiques, ce qui permet une meilleure reproductibilité12. La gravité omnidirectionnelle et la réduction des forces de cisaillement permettent aux cellules de se développer de manière plus physiologique. Pour preuve, les cellules HepG2/C3A cultivées selon cette méthodologie développent des organites sphériques qui produisent in vivo des niveaux d’ATP, d’adénylate kinase, d’urée et de cholestérol13,14. De plus, les traitements médicamenteux dans ce système 3D sont plus avancés et automatisés par rapport aux cultures 2D. Dans les cultures 2D, les traitements médicamenteux doivent souvent avoir une courte durée en raison de la nécessité de trypsiniser et de maintenir la santé cellulaire. Pourtant, dans notre cas, nous pouvons effectuer des traitements médicamenteux à long terme des sphéroïdes sans avoir besoin de perturber la structure et la physiologie des cellules. Par conséquent, un passage des cultures 2D à 3D est nécessaire pour mieux modéliser les phénomènes biologiques in vivo et poursuivre le développement scientifique.
Cet article présente une méthodologie pour la culture de sphéroïdes hautement reproductibles (Figure 1 et Figure 2) et montre un système semi-automatisé pour caractériser phénotypiquement des structures 3D (Figure 3). Au niveau de l’image, nous fournissons des informations sur le comptage et la mesure de l’aire des sphéroïdes (Figure 3). En utilisant des méthodes de spectrométrie de masse, nous montrons comment la protéomique peut être utilisée pour évaluer des fonctions biologiques spécifiques (Figure 4). En collectant et en analysant ces données, nous espérons améliorer la compréhension de la biologie derrière les systèmes de culture cellulaire 3D.

<table><tbody><tr><td>Tubes microcentrifuges de 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481754</td><td>pointe Luer lock, graduée à 12 mL</td></tr><tr><td>1000 &micro ; L pointes de pipette à large diamètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro ; Pointes de pipette à large diamètre Fisher</td><td>Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>plaque filtrante Orochem à 96 puits</td><td>Orochem&nbsp ;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à jupe à 96 puits</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>Collecteur à vide à 96 puits</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiques (BEGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor Bioréacteur</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>pour la culture cellulaire 3D</td></tr><tr><td>Incubateur ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>CO2 incubateur pour culture cellulaire 3D</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia 24 puits à fond rond Plaque de fixation ultra-basse contenant des micropuits</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>CO2 incubateur pour culture cellulaire 2D</td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Résine 30 & micro ; m</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Spectromètre de masse Tribrid</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Spectromètre de masse haute résolution</td></tr><tr><td>Microscope PAULA</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Lecteur de microplaques multi-étiquettes Victor X2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier pH</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoétanolamine</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Acide phosphorique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Résine Reprosil-Pur</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.003</td><td>120 & Aring ; taille des pores, phase C18-AQ, 3 &mu ; M taille de perle</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine modifiée de qualité séquençage</td><td>Promega</td><td>V511A</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur sous vide SpeedVac (plaques à 96 puits)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Capot stérile</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>stériles Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Siphon</td><td>en S Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille pour seringue (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>3 » de longueur, 0,05 » de diamètre</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

analyse phénotypique semi-automatisée de cultures fonctionnelles de cellules sphéroïdes 3d

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Nous présentons un protocole qui décrit les propriétés et les avantages de l’utilisation d’un incubateur de clinostat autonome pour la culture, le traitement et le suivi des cultures cellulaires 3D. Le clinostat imite un environnement où les cellules peuvent s’assembler sous forme de sphéroïdes hautement reproductibles avec de faibles forces de cisaillement et une diffusion active des nutriments. Nous démontrons que les hépatocytes cancéreux et non cancéreux (lignées cellulaires HepG2/C3A et THLE-3) ont besoin de 3 semaines de croissance avant d’atteindre des fonctionnalités comparables à celles des cellules hépatiques. Ce protocole met en évidence la commodité de l’utilisation d’incubateurs pour les cellules 3D avec des caméras surveillant la croissance cellulaire, car des instantanés peuvent être pris pour compter et mesurer les sphéroïdes lors du traitement. Nous décrivons la comparaison des lignées cellulaires THLE-3 et HepG2/C3A, montrant comment des lignées cellulaires non cancéreuses peuvent être cultivées ainsi que des cellules cancéreuses immortalisées. Nous démontrons et illustrons comment des expériences de protéomique peuvent être menées à partir de quelques sphéroïdes, qui peuvent être collectés sans perturber la signalisation cellulaire, c’est-à-dire sans trypsinisation requise. Nous montrons que l’analyse protéomique peut être utilisée pour surveiller le phénotype typique du métabolisme de la chaîne respiratoire et la production de protéines impliquées dans la détoxification des métaux et décrivons un système semi-automatisé pour compter et mesurer l’aire du sphéroïde. Dans l’ensemble, le protocole présente une boîte à outils qui comprend une caractérisation phénotypique via la capture d’images et un pipeline protéomique pour expérimenter sur des modèles de culture cellulaire 3D.

Dans ce protocole, nous décrivons les propriétés d’un incubateur cellulaire 3D innovant et sans stress, un système conçu spécifiquement pour la culture de sphéroïdes 3D (Figure 2). Nous avons optimisé le protocole pour la culture 3D des lignées cellulaires THLE-3 et HepG2/C3A. Le protocole décrit ici est simple à utiliser et permet la reproductibilité et la culture rentable de &gt; 100 sphéroïdes par bioréacteur. Une fois dans le bioréacteur, les sphéroïdes sont traités de la même manière que les cellules maintenues en culture 2D. Des conditions de croissance optimales sont obtenues en changeant les milieux deux à trois fois par semaine (figure 2B) et en ajustant la vitesse de rotation en fonction de la croissance et de la taille des sphéroïdes (figure 2C). Ce système, dans lequel des sphéroïdes 3D sont cultivés dans des bioréacteurs rotatifs (Figure 2E, F), fournit un environnement de croissance optimal pour les structures 3D en exposant le sphéroïde à une force de cisaillement égale et très faible.
Nous avons déjà montré comment les sphéroïdes peuvent être utilisés pour l’analyse de la modification de la chromatine16. Ici, nous montrons en détail comment obtenir des sphéroïdes hépatiques et comment des expériences de protéomique peuvent être menées pour l’analyse du protéome complet (Figure 1). En bref, le protocole a été initié en utilisant des cellules plates THLE-3 ou HepG2/C3A jusqu’à ce que la culture atteigne 80 % de confluence. Pour cultiver des cellules sous forme de sphéroïdes, environ 2 000 cellules ont été plaquées dans une plaque de fixation ultra-basse contenant des micropuits pour leur permettre de s’auto-agréger, puis les sphéroïdes formés ont été transférés dans un bioréacteur (Figure 1A). Bien qu’ils soient fonctionnellement actifs après 3 semaines de culture, comme démontré précédemment17, nous montrons les résultats des sphéroïdes collectés après 36 jours de culture pour ce protocole. Après la collecte, les sphéroïdes ont été filés vers le bas, et les pastilles et le surnageant ont été stockés pour analyse. La viabilité cellulaire a été évaluée à partir du surnageant pour la quantification de l’adénylate kinase libérée par les cellules endommagées, comme décrit précédemment17. Les protéines cellulaires ont été extraites de la pastille cellulaire et le protéome complet a été analysé par spectrométrie de masse à haute résolution (Figure 1B).
Ce protocole fait également la démonstration d’une méthode semi-automatisée de comptage des sphéroïdes (Figure 3A) à l’aide du programme de traitement d’images public FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Une image de bonne qualité du sphéroïde doit être prise pour l’analyse, et certains paramètres doivent être pris en compte comme mentionné à la section 5. Ensuite, après avoir préparé l’image pour l’analyse, un script macro (Fichier supplémentaire 1) est utilisé pour compter les sphéroïdes. La macro fonctionne en créant d’abord un dossier appelé FIJI Spheroids counting, à l’intérieur du dossier où se trouvent les images sphéroïdes. Dans ce dossier, toutes les informations de l’analyse sont enregistrées. Cela inclut une photo des sphéroïdes qui ont été comptés, avec un numéro d’identification sur chaque sphéroïde. Il comprend également un fichier Excel appelé comptage sphéroïde. Ce fichier contient la zone de pixel et le numéro d’identification de chaque sphéroïde qui a été compté. Les données correspondant à une image analysée sont présentées dans chaque onglet du fichier. L’onglet est étiqueté en fonction du nom de l’image analysée. Comme la taille des sphéroïdes peut être altérée par de nombreux facteurs, notamment le nombre de structures à l’intérieur d’un vaisseau et le traitement médicamenteux, il est également important de surveiller leur surface (planimétrie). Le script macro présenté ici (fichier supplémentaire 2) fonctionne en mesurant les zones noires, qui correspondent aux sphéroïdes de l’image (Figure 3B). La sortie est rassemblée dans un fichier appelé planimétrie.xlsx, qui contient la surface, le périmètre et le diamètre mesurés de chaque sphéroïde. Il existe également une mesure appelée Féret, utilisée pour calculer le diamètre. Le diamètre du Féret est le plus long possible, tandis que le diamètre du minFéret est le plus court. Le diamètre est la moyenne de ces deux. Dans le dossier de sortie, outre le fichier planimétrique.xlsx, il y a aussi une image des sphéroïdes qui ont été mesurés.
Avant de procéder à l’analyse du protéome, la viabilité des sphéroïdes a été évaluée au cours de la culture. Les niveaux d’AK augmentent jusqu’au jour 17, atteignant environ 7 % de la mort cellulaire, puis la mortalité diminue jusqu’à des niveaux inférieurs à 5 % (Figure 4A), ce qui est conforme aux travaux publiés précédemment17. Ce protocole montre également l’analyse complète du protéome pour le suivi du phénotype cellulaire. Tout d’abord, les protéomes des cellules plates et des sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A ont été comparés. En analysant le premier composant principal (PC1), il est évident qu’il y a une séparation stricte des échantillons sphéroïdes des cultures de cellules plates, et il semble que la corrélation du type de cellule (THLE-3 et HepG2/C3A) ne soit pas pertinente (Figure 4B). Bien que les sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A ne se regroupent pas, ils partagent des profils similaires compatibles avec la fonction hépatique. Nous démontrons dans ce protocole l’exemple des métallothionéines, qui ont un rôle dans la détoxification des métaux effectuée par le foie. Nous avons identifié dans l’analyse protéomique 2 isoformes surexprimées dans les sphéroïdes par rapport aux cellules plates (MT1E et MT1X) (Figure 4C). Nous montrons également l’enrichissement en ontologie génique (GO) des deux lignées cellulaires cultivées sous forme de sphéroïdes. Le processus métabolique glucidique, qui comprend le cycle de l’acide tricarboxylique (cycle TCA), la chaîne de transport d’électrons (respiration cellulaire) et le métabolisme du pyruvate, est un terme fréquent et est enrichi en sphéroïdes HepG2/C3A et THLE-3 (Figure 4D,E). La détoxification cellulaire, le métabolisme des acides gras et du cholestérol sont d’autres fonctions enrichies dans les deux sphéroïdes. Ensemble, ces fonctions sont connues pour être cruciales pour la fonction hépatique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail pour la culture de sphéroïdes et la préparation d’échantillons. (A) Approche expérimentale de la culture cellulaire 3D. Des cultures de cellules plates à la confluence désirée ont été trypsinisées et ensemencées sur une plaque de 24 puits à fixation ultra-faible contenant des micropuits, où les cellules s’auto-assemblent en sphéroïdes. Après 24 h, les sphéroïdes ont été transférés dans un bioréacteur et cultivés jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être analysés. (B) Après la collecte, les sphéroïdes ont été granulés et les pastilles et le surnageant de culture ont été entreposés jusqu’à leur traitement. Les protéines histones16et non-histones ont été extraites, digérées en peptides et analysées par spectrométrie de masse à haute résolution. Les fichiers bruts obtenus à partir de la spectrométrie de masse ont été recherchés dans la base de données humaine, et les données ont été traitées ultérieurement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Figure 2 : Système de culture cellulaire 3D. (A) Pièces de bioréacteur. Le bioréacteur est composé d’une chambre d’échange gazeux et d’humidification contenant des billes d’eau et d’une chambre cellulaire ouvrante avec deux bouchons pour l’échange de milieux et la collecte des sphéroïdes. (B) Échange de milieux de bioréacteurs. Le bioréacteur est rempli de 10 mL de milieu de culture à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille. (C) L’application de contrôle du système. La vitesse de rotation, le niveau de CO2, la température, le journal des alarmes et d’autres fonctionnalités peuvent être contrôlés à l’aide de l’unité de commande. (D) Placer le bioréacteur dans l’incubateur 3D. Chaque bioréacteur est associé à un moteur qui peut faire tourner le bioréacteur lentement. (E) Bioréacteur en mouvement avec la vitesse (tr/min) contrôlée par un comprimé (C). La vitesse (tr/min) est ajustée en fonction de la taille des sphéroïdes. (F) Bioréacteurs à l’intérieur de l’incubateur 3D. L’incubateur 3D peut accueillir jusqu’à 6 bioréacteurs contrôlés individuellement. Photo reproduite avec l’aimable autorisation de Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Figure 3 : Caractérisation phénotypique des sphéroïdes par capture d’image. (A) Comptage semi-automatisé des sphéroïdes. Après avoir pris des clichés des sphéroïdes dans le bioréacteur, l’image est préparée pour être analysée aux FIDJI. Chaque sphéroïde est compté et un numéro d’identification est fourni pour chacun d’eux. Une macro est utilisée et les résultats sont affichés indiquant l’ID du sphéroïde compté, l’étiquette (nom de l’image analysée) et la zone (le nombre de pixels comptés dans le sphéroïde). (B) Détermination planimétrique de l’aire sphéroïdale. À l’aide d’une macro, l’aire, le périmètre et le diamètre d’un sphéroïde spécifique sont déterminés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse du protéome des sphéroïdes hépatiques. (A) La viabilité des sphéroïdes a été calculée sur la base de la libération d’adénylate kinase (AK) sur le surnageant de culture. Les résultats sont les moyens de points de données dupliqués ± écart-type. (B) Une analyse en composantes principales (ACP) a été effectuée pour comparer le protéome des cellules planes et des sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A. (C) Abondance relative des métallothionéines, qui sont des protéines exprimées par le foie humain. Les données sont représentées sous forme de moyens ± MEB. (D) Les réseaux regroupés fonctionnellement montrent l’enrichissement GO pour les sphéroïdes HepG2/C3A et (E) les sphéroïdes THLE-3, où seule l’étiquette du terme le plus significatif par groupe est indiquée. Le réseau a été construit à l’aide de ClueGo19. La taille du nœud représente l’importance de l’enrichissement du terme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Script de macro pour le comptage des sphéroïdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Macro pour la détermination planimétrique des sphéroïdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons un protocole de culture de sphéroïdes hautement reproductibles et leur caractérisation phénotypique par capture d’images et protéomique.

Analyse phénotypique semi-automatisée de cultures fonctionnelles de cellules sphéroïdes 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Ce protocole montre comment cultiver des sphéroïdes hautement reproductibles et montre comment des expériences protéomiques peuvent être menées pour caractériser la fonction biologique des structures 3D. Notre culture 3D peut produire simultanément des centaines de répétitions biologiques dans le même bioréacteur, et l’approche LC-MS peut mesurer l’abondance de milliers de protéines en une seule expérience. Stephanie Stransky, une postdoctorante du laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer, prenez la suspension des cellules HepG2/C3A et THLE-3. Comptez le nombre de cellules et diluez la suspension cellulaire dans un milieu de croissance complet pour obtenir 1 million de cellules dans un volume maximum de 1,5 millilitre. Lavez les puits d’une plaque inférieure ronde à 24 puits à très faible adhérence avec 0,5 millilitre de milieu de culture et centrifugez à 3 000 g pendant cinq minutes.Transférez la suspension cellulaire sur la plaque et centrifugez-la pendant trois minutes à 120 g. Ensuite, incubez la plaque pour initier la formation de sphéroïdes. Ensuite, équilibrez le bioréacteur 24 heures avant de transférer les sphéroïdes en remplissant la chambre d’humidité avec 25 millilitres d’eau stérile et la chambre cellulaire avec neuf millilitres de milieu de culture à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec une longue aiguille.Ensuite, placez le bioréacteur dans un incubateur 3D pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Pipetez doucement les sphéroïdes de haut en bas à l’aide d’embouts d’alésage d’un millilitre de large pour les détacher de la plaque de fixation ultra-basse et les transférer dans une boîte de culture tissulaire. Pour capturer les sphéroïdes restants, lavez la plaque avec 0,5 millilitre de milieu de culture préchauffé et transférez-les dans la boîte de culture.À l’aide d’un microscope optique, évaluez la taille, la compacité et la rondeur des sphéroïdes pour sélectionner ceux qui sont correctement formés. Transférez le sphéroïde sélectionné dans le bioréacteur d’équilibre rempli de cinq millilitres de milieu de culture frais. Ensuite, remplissez l’ensemble du bioréacteur avec un nouveau milieu de culture.Positionnez le bioréacteur dans l’incubateur 3D et ajustez la vitesse de rotation à l’aide de l’unité de commande. Remplacez 10 millilitres de substrat ancien par 10 millilitres de substrat frais tous les deux à trois jours. Modifiez la vitesse de rotation à chaque fois après avoir remplacé le support.Cultivez les sphéroïdes pendant 15 jours et répartissez-les entre deux bioréacteurs frais. Ouvrez l’application 3D installée sur la tablette, sélectionnez le bioréacteur et capturez l’image. Comme alternative, placez un fond noir derrière le bioréacteur et assurez-vous qu’aucune lumière n’est réfléchie sur la chambre cellulaire.Capturez l’image aussi près que possible du bioréacteur. Ensuite, collectez les sphéroïdes en retirant cinq millilitres de milieu du bioréacteur à l’aide d’une seringue attachée à une longue aiguille par l’orifice supérieur. Assurez-vous que les sphéroïdes descendent vers le centre inférieur du bioréacteur.Maintenant, ouvrez l’orifice avant et collectez les sphéroïdes à l’aide d’une pointe d’alésage large d’un millilitre. Transférez ces sphéroïdes dans des microtubes à centrifuger, centrifugez à 500 g pendant cinq minutes et jetez le milieu. Lavez le sphéroïde en ajoutant 200 microlitres de HBSS pour éliminer le FBS.Après cela, effectuez une centrifugation à 500 g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Ensuite, plongez rapidement la pastille sphéroïde dans de l’azote liquide pour la congeler et stockez cette pastille congelée à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit traitée. Pour lyser les cellules, prenez un tube de sphéroïdes collectés et remettez-les en suspension dans 25 microlitres de SDS à 5%.Homogénéiser la pastille en pipetant de haut en bas. Ensuite, dissoudre un microgramme d’échantillons et 10 microlitres d’acide trichloracétique à 0,1 %. Après avoir extrait la protéine et nettoyé les échantillons, mettez en place la méthode d’acquisition MS pour générer les spectres MS/MS à partir des signaux peptidiques identifiés.Ensuite, transférez la plaque dans l’échantillonneur automatique de chromatographie liquide nanolitre. Réglez le balayage MS complet sur un rapport masse/charge de 300 à 1,100 dans l’Orbitrap. Ajustez la résolution à 120000 et réglez la cible de contrôle automatique du gain sur 125.Ensuite, réglez MS/MS dans l’Orbitrap avec une fenêtre d’isolement séquentielle de 50 rapport masse/charge. Visez la cible de contrôle automatique du gain à 400 et définissez une énergie de dissociation collisionnelle d’énergie plus élevée de 30. Selon l’analyse de viabilité des sphéroïdes, les niveaux d’adénylate kinase augmentent jusqu’au jour 17, entraînant environ 7 % de la mort cellulaire.Par la suite, le taux de mortalité diminue à moins de 5%De plus, une analyse du premier composant principal révèle une distinction claire entre les échantillons sphéroïdes et les cultures de cellules plates. L’analyse protéomique a indiqué que les sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A ont des profils similaires qui reflètent la fonction hépatique. De plus, les sphéroïdes ont montré une surexpression de deux isoformes de métallothionéines par rapport aux cellules plates.Des réseaux fonctionnellement groupés ont montré un enrichissement en ontologie des gènes pour le processus métabolique des glucides dans les sphères HepG2/C3A et THLE-3. Pour éviter le déversement du milieu de culture, n’ouvrez pas et ne fermez pas l’orifice avant lorsque la chambre cellulaire est complètement remplie de liquide. La préparation et l’analyse des échantillons décrites dans ce protocole peuvent être utilisées pour explorer le protéome de la culture cellulaire à l’aide de méthodes 2D et 3D, ainsi que des échantillons de tissus.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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