Name: Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Découvrez l'ingénierie des protéines par affichage de surface de levure pour enrichir les variants liant des antigènes spécifiques. Cette méthode offre un contrôle précis des conditions de sélection et une visualisation par cytométrie en flux.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimisation des fonctions protéiques grâce à des techniques d’affichage de surface de levure

L’affichage de la surface de la levure est l’une des technologies clés dans le domaine de l’ingénierie des protéines. Il permet de sélectionner des variantes de protéines présentant les propriétés souhaitées telles qu’une affinité ou une stabilité améliorées. Introduite pour la première fois en 19971, c’est l’une des technologies d’affichage les plus couramment utilisées avec l’affichage des phages 2,3, l’affichage des ribosomes4 et l’affichage des cellules de mammifères 5,6,7. La protéine d’intérêt (POI) est affichée à la surface des cellules de levure en la fusionnant pour ancrer des protéines. Une gamme de protéines d’ancrage différentes est disponible, et le plus souvent, le POI est fusionné à l’extrémité C-terminale de la protéine d’accouplement de l’agglutinine de levure Aga2p 1,8. De plus, le POI est généralement flanqué de deux marqueurs, tels qu’un marqueur d’hémagglutinine (HA-tag) et un marqueur c-myc, qui permettent de détecter le niveau d’affichage à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence et de la cytométrie en flux (Figure 1A). Les campagnes typiques de sélection de levures impliquent une combinaison de sélections de billes magnétiques et de tri cytométrique en flux. Les sélections de billes permettent de gérer un grand nombre de cellules et d’enrichir les variants protéiques se liant à l’antigène cible, même avec de faibles affinités, car les interactions multivalentes avec les billes chargées d’antigène entraînent des effets d’avidité et, par conséquent, empêchent la perte de variants de faible affinité (Figure 1B). L’analyse et la sélection par cytométrie en flux offrent l’avantage de visualiser la liaison des variants POI affichés à l’antigène marqué. Par conséquent, les populations de liaison peuvent être triées et cultivées, ce qui permet d’enrichir les variantes protéiques avec les caractéristiques souhaitées tout au long de plusieurs cycles de tri. De plus, des cycles supplémentaires de mutagénèse aléatoire peuvent être effectués pour augmenter davantage la diversité et, par conséquent, la probabilité de trouver des mutations supplémentaires qui contribuent à l’affinité et/ou à la stabilité de la protéine.
L’affichage de la surface de la levure présente certains avantages, tels que (a) la machinerie d’expression eucaryote, permettant le repliement oxydatif des protéines ainsi que les modifications post-traductionnelles eucaryotes (telles que la N-glycosylation), (b) la normalisation de l’expression due à la détection des deux marqueurs peptidiques flanquant la protéine, (c) l’inspection visuelle de la progression de la sélection par cytométrie en flux (par exemple, le pourcentage de cellules de liaison et l’intensité de liaison) et (d) la possibilité d’analyser les mutants protéiques individuels sur levure (par exemple, en analysant la thermostabilité ainsi que l’affinité), présentant une alternative permettant de gagner du temps à l’expression et à la purification laborieuses des protéines9. En fait, les affinités (valeurs KD) ainsi que les stabilités (valeurs T50) des protéines de surface de la levure ont montré de bonnes corrélations avec les données obtenues par des méthodes biophysiques et les protéines solubles 9,10,11,12. L’affichage de la surface de la levure a été utilisé pour l’ingénierie d’une variété de protéines, par exemple, les fragments d’anticorps13, 14, 15, 16, le 10e domaine de fibronectine de type III17, 18, rcSso7d19, 20 ou les nœuds21. De même, des recherches approfondies ont été entreprises pour optimiser la conception des banques de levures en modifiant les positions aléatoires ainsi que l’utilisation des codons d’acides aminés 17,22,23. L’affichage de la surface de la levure s’est avéré efficace pour l’ingénierie de la stabilité 14,15,24,25, de l’affinité 18,26,27, de l’activité enzymatique 28,29,30,31 et de l’expression des protéines32. De plus, des applications plus sophistiquées telles que la liaison conditionnelle en présence ou en l’absence d’une petite molécule ont été réalisées à l’aide de l’affichage de surface de levure20.
Dans ce protocole, nous décrivons toutes les étapes essentielles à une campagne de sélection avec affichage de surface chez la levure avec l’exemple de la banque G4 (basée sur le 10ème domainede fibronectine de type III, Fn3) sélectionnée contre l’antigène de la protéine de liaison au rétinol humain 4 (hRBP4) en présence de la petite molécule A112020. Cette sélection a été menée pour produire une interaction protéine-protéine qui dépend d’une petite molécule pouvant être utilisée comme interrupteur moléculaire. Il convient de noter que, bien que d’autres approches soient possibles avec l’affichage de la surface de la levure, les sélections typiques de levures visent généralement à se lier à un antigène cible sans aucune affinité de liaison préalable. Nous couvrons toutes les étapes d’une campagne de sélection de levures, impliquant la culture d’une bibliothèque de levures, la sélection de billes, le tri cytométrique en flux et la maturation d’affinité par PCR sujette aux erreurs (epPCR). Par conséquent, ce protocole complète les protocoles précédents d’affichage de surface de levure33,34 et peut être utilisé comme base pour les sélections d’affichage de surface de levure (Figure 1) avec n’importe quelle bibliothèque de levure donnée et antigène cible de choix.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
Figure 1 : Principe de l’affichage de la surface de la levure et un flux de travail typique pour les sélections d’affichage de la surface de la levure. (A) Le POI est cloné dans un vecteur d’affichage de surface de levure et généralement flanqué d’un marqueur N-terminal HA- et d’un C-terminal c-myc-tag. La construction est fusionnée à la protéine d’accouplement de levure Aga2p pour être affichée à la surface. La protéine représentée est le liant technique « RS3 » de l’ID PDB : 6QBA20. (B) Organigramme illustrant un flux de travail typique pour les campagnes de sélection d’affichage de surface de levure, qui combinent l’enrichissement des variantes protéiques avec les propriétés souhaitées par sélections de billes et le tri cytométrique en flux, ainsi que l’epPCR pour la maturation d’affinité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>10-bêta électrocompétent E. coli&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Sel sodique d’ampicilline</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-c-myc, clone 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-c-myc, clone 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-HA, clone 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-HA, clone 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, fraction éthanol froid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Base azotée de levure Difco</td><td>Becton Dickinson (BD)&nbsp ;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate disodique heptahydraté</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée phosphate (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Liant à la biotine</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Magnet Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation 1 mm (pour E.coli)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation 2 mm (pour levure)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>Absolu d’éthanol</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II Kit de mutagénèse aléatoire</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose& nbsp ;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de lithium dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Kit d’extraction de gel d’ADN</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & Kit de nettoyage de l’ADN</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’excroissance</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Penta-His, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Penta-His, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Peptone ex caséine digérée tryptiquement</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ADN polymérase haute fidélité&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Filtre fileté Steritop</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Citrate tri-sodique dihydraté</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure, micro-granulé</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Levure Plasmide Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Protein Engineering by Yeast Surface Display

La banque G4 a été sélectionnée contre l’antigène hRBP4 lié à la petite molécule médicament A1120. La coloration des banques pour le tri cytométrique en flux a été effectuée comme décrit dans la méthode 6, et la stratégie de contrôle appliquée est illustrée à la figure 2A. Une première porte comprenait toutes les cellules en fonction de la morphologie cellulaire, et la deuxième porte (histogramme de FSC-Width) a montré une stratégie de contrôle stricte qui a été appliquée pour sélectionner des cellules uniques et éliminer les agrégats de cellules. La troisième et dernière porte a montré l’affichage des variantes protéiques (axe x) par rapport à la liaison à l’antigène (axe y). Les cellules de levure présentant à la fois des signaux d’affichage et de liaison ont été triées. Il est important de noter que la porte de tri a été réglée de manière stricte pour enrichir les domaines de liaison avec un signal de liaison élevé et donc une affinité élevée. Cette sélection rigoureuse a permis d’obtenir un enrichissement de cellules de levure qui se lient spécifiquement à l’antigène cible tout au long de la campagne de sélection (Figure 2B). Lors de cycles ultérieurs de tri par cytométrie en flux, la concentration d’antigène a été divisée par 10 (de 100 nM à 10 nM). Par conséquent, le signal de liaison global a été réduit, et seuls les liants ayant une affinité élevée étaient encore détectables et triés (Figure 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
Figure 2 : Résultats représentatifs d’une sélection d’affichage à la surface de la levure de la banque G4 basée sur Fn3 pour la liaison à l’antigène (hRBP4 en présence de A1120). (A) La stratégie générale de contrôle pour le tri des banques de levures. La première étape (FSC vs. SSC) consiste à sélectionner toutes les cellules de levure et à exclure les événements de diffusion ; la deuxième porte (histogramme de FSC-W) vise à éliminer les agrégats cellulaires et à ne sélectionner que des cellules de levure uniques. La troisième porte représente le niveau d’affichage de surface (détection de l’étiquette HA ou c-myc) par rapport à la liaison à l’antigène (ici hRBP4 en présence de 5 μM A1120, détecté par l’anticorps anti-HIS). La banque a en outre été colorée avec des anticorps secondaires uniquement (sans antigène), alors qu’aucune liaison à l’antigène n’est attendue. Les cellules triées sont surlignées en bleu. (B) Evolution de la banque G4 à travers 3 cycles de tri cytométrique en flux. L’enrichissement de la population de liaison peut être observé à chaque cycle de sélection. (C) L’utilisation de concentrations d’antigènes plus faibles permet de sélectionner des variantes de protéines ayant une plus grande affinité envers l’antigène cible. Lors de la réduction de la concentration de l’antigène (ici hRBP4) de 10 fois, différentes diagonales apparaissent, indiquant la présence de clones ayant une affinité supérieure (cellules triées, bleue) ou plus faible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

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