Name: Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Découvrez l'ablation par laser à deux photons d'ostéoblastes chez les larves de Danio rerio pour étudier la régénération osseuse et la réponse immunitaire. Cette méthode permet d'analyser le rôle des macrophages dans la guérison.

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Le protocole d’étude a reçu l’approbation de la Landesdirektion Sachsen, numéros de permis 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Les souches de poisson-zèbre utilisées ont été maintenues conformément à la législation nationale et dans des conditions normalisées comme décrit précédemment27,28. Les détails de tous les réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation des matériaux et des solutions
<ol><li>Conservez les embryons dans 1x milieu E3. Préparez le média 1x E3 en diluant 170 ml d’un bouillon 60x E3 dans 10 L d’eau désionisée et en ajoutant 2 ml de bleu de méthylène à 0,1 %.<ol><li>Préparez le support 60x E3 en mélangeant 17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,90 g de CaCl2·2 H2O, 4,90 g de MgSO4·7 H2O dans 1 L d’eau autoclavée désionisée.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour l’enrobage des larves, préparez à l’avance des aliquotes d’agarose à bas point de fusion (LMA) à 1 % et conservez-les à température ambiante.<ol><li>Pour préparer des aliquotes, dissoudre le LMA dans 1 milieu E3, p. ex., 500 mg de LMA dans 50 ml de 1 X E3 dans un erlenmeyer, chauffer la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement, et la distribuer dans des aliquotes de 1 mL dans des tubes de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Élevage de poissons-zèbres et collecte d’embryons
REMARQUE : Des larves de poisson-zèbre double transgénique signalant la présence d’ostéoblastes engagés [osterix :nGFP = Tg(Ola.Sp7 :NLS-GFP)zf132]29 et de macrophages [mpeg :mCherry = Tg(mpeg :mCherry)gl23] ont été utilisés ici30 (Figure 1A).
<ol><li>Installez le poisson-zèbre parental avec les transgènes uniques souhaités dans des cages d’accouplement standard la veille de l’accouplement. REMARQUE : Les cages d’accouplement standard permettent aux œufs de passer dans un compartiment inférieur où le poisson-zèbre parental ne peut pas les atteindre.<ol><li>Gardez les mâles et les femelles séparés jusqu’à l’accouplement à l’aide d’un séparateur dans la cage d’accouplement. Retirez le séparateur le matin du lendemain pour commencer l’accouplement.</li>
	</ol></li>
	<li>À midi, au plus tard, retirez les poissons-zèbres parentaux des bassins d’élevage et collectez les embryons, en filtrant l’eau de la cage d’accouplement à travers un tamis. REMARQUE : Dans le cas où l’âge exact des larves est décisif, récoltez les embryons à intervalles réguliers d’environ 30 minutes. Les compagnons de couvée doivent être utilisés dans des expériences avec différents groupes expérimentaux.</li>
	<li>Placez les embryons dans une boîte de 100 mm de diamètre contenant 1 milieu E3 et conservez-les dans un incubateur à 28 °C31.</li>
	<li>Retirez les ovules non fécondés et les embryons morts de la boîte à l’aide d’une pipette en plastique à l’aide d’un stéréomicroscope et changez 1x milieu E3 par jour.</li>
	<li>Avant l’expérience, triez les larves positives pour les transgènes rapporteurs à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence.</li>
</ol>3. Intégration des larves dans l’agarose à bas point de fusion
<ol><li>Faire fondre les aliquotes de LMA dans un thermobloc ou un bain-marie à 65 °C. Une fois que le LMA est fondu, maintenez-le à 42 °C jusqu’à ce qu’il soit intégré (Figure 1B). Ajouter 50 μL de MS-222 à 0,4 % à 1 mL d’aliquote de LMA fondue pour obtenir une concentration de MS-222 de 0,02 % pour l’anesthésie.</li>
	<li>Anesthésier 4 dpf (jours après la fécondation) larves (ou larves plus âgées) dans un milieu MS-222 E3 à 0,02 %.</li>
	<li>Transférez les larves anesthésiées dans une boîte à micropuits à fond de verre à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 3 mL et retirez l’excédent de milieu E3 avec la même pipette (figure 1B). Évitez le dessèchement des larves. REMARQUE : Plus d’une larve peut être incrustée dans une boîte simultanément ; Il est recommandé d’encastrer 3 à 5 larves pour laisser suffisamment de temps pour la mise en place.</li>
	<li>Prenez l’agarose LMA fondue du bain-marie/thermobloc et ajoutez une goutte (rafraîchissante) de LMA dans le plat, en recouvrant le fond de verre où les larves étaient positionnées. Faites attention à ce que le LMA ne soit pas trop chaud mais toujours liquide.</li>
	<li>Ensuite, placez les larves dans la position latérale souhaitée avant que l’agarose ne se solidifie. Ici, assurez-vous d’une position latérale dans laquelle l’opercule est aussi proche que possible du fond en verre de la boîte en préparation à la configuration du microscope inversé (Figure 1B).</li>
	<li>Laissez l’agarose se solidifier, puis ajoutez du milieu E3 (contenant un maximum de 0,02 % de MS-222) dans le plat pour éviter le dessèchement de l’agarose (figure 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la procédure d’enrobage. (A) Double transgénique Tg(osterix :nGFP ; 29,30 larves de poisson-zèbre avec des ostéoblastes operculaires marqués en vert et des macrophages marqués en rouge ont été utilisés. (B) Le flux de travail de la procédure d’intégration, tel que décrit à l’étape 3 du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
4. Imagerie in vivo des larves et ablation laser
<ol><li>Pour ablater au laser des ostéoblastes dans l’opercule en développement du poisson-zèbre transgénique Tg(osterix :nGFP ; mpeg1 :mCherry)29,30, utilisez un microscope à balayage laser à deux photons inversé avec un objectif à eau 25x/0,95 ou une configuration équivalente.</li>
	<li>Placez la boîte avec les larves incrustées sur la platine microscopique du microscope inversé et positionnez la région souhaitée pour l’ablation au centre du champ de vision. L’opercule peut être facilement identifié à l’aide du signal de fluorescence GFP.</li>
	<li>Une fois que l’opercule est focalisé et centré dans le champ de vision du microscope, choisissez les paramètres de pile z (souvent des intervalles z de 1 à 2 μm sont utilisés) pour imager toute la largeur de l’opercule. Dans le même temps, choisissez la zone dans un plan z spécifique à ablater (généralement dans la zone postérieure de l’opercule). L’ablation laser à deux photons n’est exercée que dans ce plan. REMARQUE : Une résolution plus élevée dans la dimension z entraînera des temps d’imagerie plus longs, mais permettra des analyses volumétriques des données acquises plus tard.</li>
	<li>Imagez la zone d’intérêt de l’opercule avant l’ablation. Pour la détection GFP, utilisez un laser à lumière blanche à 488 nm et un détecteur hybride allant de 495 nm à 550 nm ou équivalent. Imagez les macrophages à l’aide d’une excitation de 555 nm (laser à lumière blanche), avec une portée de détection mCherry de 595 à 780 nm sur un détecteur hybride (ou équivalent).<ol><li>Utilisez le format d’image 512 x 512 pour un bon rapport qualité/temps (d’autres formats peuvent être utilisés si une résolution plus élevée ou une vitesse plus élevée sont souhaitées). REMARQUE : Un incubateur à température contrôlée installé au microscope peut être utilisé et réglé, par exemple, à 28 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dessinez une région circulaire d’un diamètre de 25 μm (d’autres formes et tailles peuvent être sélectionnées en fonction de l’expérience) dans un plan 2D sélectionné, en mettant l’opercule en focus à l’aide de l’outil ROI.</li>
	<li>Pour effectuer l’ablation, appliquez une puissance d’ablation (mesurée sans objectif) à 450 mW et exposez la zone sélectionnée au laser à deux photons à une vitesse de balayage de 400 Hz et une durée totale de 10 s. Lors de l’ablation, la zone peut être visualisée à l’aide d’un détecteur hybride dans la gamme de 401 à 443 nm ou équivalent.</li>
	<li>Après l’ablation, confirmez la structure de l’ablation en imageant à nouveau la même pile z avec les mêmes paramètres que ceux utilisés avant l’ablation. La zone ablatée ne contient plus de cellules fluorescentes.</li>
</ol>5. Récupération des larves et imagerie pour suivre le recrutement des cellules immunitaires
<ol><li>Si l’imagerie du recrutement des cellules immunitaires doit être effectuée avec un certain retard, récupérer les larves de l’imagerie et de l’anesthésie. Retirez soigneusement les larves de la LMA à l’aide d’une pince ou d’une aiguille de dissection.<ol><li>Tout d’abord, retirez une couche d’agarose recouvrant les larves. Deuxièmement, retirez l’agarose en contact direct avec les larves. Omettez cette étape si l’imagerie immédiate du recrutement des cellules immunitaires a lieu.</li>
	</ol></li>
	<li>Remettez les larves dans un plat avec un milieu E3 pur et vérifiez leur récupération. Le rétablissement est évident par la nage des larves.</li>
	<li>À 4 ou 6 hpl (heures après la lésion), imagez à nouveau la zone de l’opercule en utilisant les mêmes réglages au même microscope pour vérifier les effets de l’ablation sur le recrutement des macrophages. Pour ce faire, répétez l’intégration (étape 3) et l’imagerie comme effectué précédemment (étape 4).</li>
	<li>Après l’imagerie, retirer les larves de la LMA. Le sacrifice des larves peut être effectué soit par incubation dans de l’eau glacée, soit par surdosage de MS-222 dans E3, selon les exigences légales. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour des études de suivi ou être éliminés.</li>
</ol>6. Analyse d’images et analyse statistique
<ol><li>Traitez les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’images tel que Fiji32. En fonction de la résolution z des données acquises, les analyses peuvent être effectuées en 2D ou en 3D.</li>
	<li>Quantifiez les macrophages manuellement en incluant des cellules clairement séparées, par exemple en discernant les corps cellulaires principaux, ou en quantifiant les cellules avec un marqueur nucléaire ou en mesurant l’aire en cas de chevauchement des cellules (étape suivante).</li>
	<li>Pour quantifier la zone, créez un masque englobant les macrophages. Pour ce faire, utilisez l’outil Image &gt; Adjust &gt; Threshold et créez un ROI (Analyze &gt; Tools &gt; ROI Manager &gt; Add) aux Fidji. Exclure les petites particules en arrière-plan pour la quantification.<ol><li>Ensuite, mesurez la surface (Analyser &gt; Mesurer). Déterminez si les zones de fluorescence cellulaire qui se chevauchent doivent être incluses dans la mesure. REMARQUE : Ici, la zone d’ablation circulaire a été omise des mesures de zone car les macrophages recrutés ne peuvent pas être distingués dans cette zone.</li>
	</ol></li>
	<li>Générez des graphiques traçant les résultats de mesure à l’aide d’un logiciel approprié. Pour comparer les données avant et après l’ablation, effectuez un test statistique approprié (ici, un test t unilatéral apparié a été effectué). REMARQUE : Les figures peuvent être préparées à l’aide d’un logiciel de retouche photo et de conception graphique.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Méthode d’ablation laser pour étudier la régénération osseuse chez les larves de poisson-zèbre

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<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté, CaCl2&middot ; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Antenne parabolique de culture cellulaire, PS, 100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>Forme de l’embout droit, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm</td></tr><tr><td>Falcon Plaque à 6 puits</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>Antenne à micropuits à fond de verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Antenne parabolique de 35 mm, lamelle de recouvrement n° 1,5, diamètre du verre de 14 mm,</td></tr><tr><td>laser multiphotonique Insight X3</td> non revêtu, <td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Leica Application Suite</td><td>LAS X, Leica Microsystems</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion.</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Plaque Agarose</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4&middot ; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr>Cages <td></td><td></td><td>d’accouplement</td><td>de nombreuses variétés, p.ex. Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium, KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 FALCON&nbsp ;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Equipé d’un laser multiphotonique Insight X3 et du logiciel Leica Application Suite</td></tr><tr><td>Acier inoxydable Dissect Needle</td><td>Bochem</td><td>12010</td><td>140 mm</td></tr><tr><td>Stereo Microscope System SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>Equipé d’une base d’éclairage LED SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>Armoires thermostatiques TS - WTW</td><td>xylem</td><td>TS 608/2-i</td><td>Pour l’incubation (embryon)</td></tr><tr><td>Transfert pipette, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm, LD-PE, transparente</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.</td><td>Zeiss équipé d’une</td><td>caméra Axiocam MRm et d’un</td><td></td> logiciel AxioVision</tr></tbody></table>

ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

L’ablation au laser a été effectuée comme indiqué dans le protocole ci-dessus. Le signal GFP des ostéoblastes dans la zone ablée a disparu instantanément après l’ablation. Pour étudier la réponse de l’ablation des ostéoblastes en termes de réponse immunitaire, la présence de macrophages chez les larves de 6 dpf avant et à 6 hpl a été imagée. Avant l’ablation, très peu de macrophages ont été observés dans la zone de l’opercule10 (Figure 2). À 6 hpl, une forte accumulation de macrophages dans la région de l’opercule ablaté et un nombre accru de macrophages dans le champ de vision, y compris l’opercule et la zone entourant l’opercule, ont été détectés10 (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> Figure 2 : Recrutement de macrophages à 6 hpl chez 6 larves de poisson-zèbre dpf. Zone de l’opercule sans ablation et à 6 hpl. Les ostéoblastes operculaires sont marqués en vert, les macrophages en magenta, et le cercle pointillé indique la zone ablée au laser. Barre d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le recrutement des macrophages a également été analysé chez des larves de 4 dpf avec des opercules beaucoup plus petits à 4 hpl, observant des résultats similaires (figure 3). La quantification du nombre de macrophages (en dehors du site d’ablation laser immédiat) a montré une augmentation dans la période étudiée (4,00 ± 2,37 macrophages avant l’ablation contre 7,00 ± 2,76 macrophages à 4 hpl) (Figure 3B). De même, la surface des macrophages (mesurée en μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 avant ablation contre 1553 μm2 ± 869,9 μm2 à 4 hpl) a augmenté (Figure 3C). Comme les macrophages sont parfois difficiles à distinguer, il est recommandé de mesurer la surface des macrophages au lieu du nombre de macrophages, comme cela a été fait ici.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> Figure 3 : Recrutement de macrophages à 4 hpl chez 4 larves de poisson-zèbre dpf. (A) Région de l’opercule sans ablation et à 4 hpl. Les ostéoblastes operculaires sont marqués en vert, les macrophages en magenta, et le cercle pointillé indique la zone ablée au laser. Barre d’échelle : 50 μm. (B) Quantification du nombre de macrophages dans la zone de l’opercule directement avant (0 hpl) et après l’ablation (4 hpl). (C) Quantification de la surface des macrophages (site d’ablation laser exclu). Tests t unilatéraux appariés. Chaque point représente les données d’une larve, et la moyenne ± SD est indiquée, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie, l'imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Lésions rénales aiguës (IRA) chez les humains est un problème clinique fréquent causé par des dommages aux cellules épithéliales qui forment néphrons du rein, et Aki est associée à des taux de mortalité élevé de 50-70% 1. Suite à la destruction des cellules épithéliales, néphrons ont une capacité limitée à se régénérer, même si les mécanismes et les limites qui guident ce phénomène reste mal compris. Dans cet article, vidéo, nous décrivons notre technique pour l'ablation laser ciblée des...

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

La méthode présentée ici comprend la blessure précise des embryons de poisson zèbre en direct avec des impulsions laser de haute énergie et l'analyse subséquente de ces blessures et leur récupération avec le temps. Nous montrons aussi comment génétiquement étiquetés simple ou groupes de cellules musculaires squelettiques peuvent être suivis pendant et après la lumière laser dommages induits.

Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Cette vidéo décrit la méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant l’axotomie laser à deux photons et en observant la récupération axonale après une blessure.

L’axotomie laser à deux photons : une méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre et observer la récupération axonale

Source : Morsch, M.,  et al., Déclenchement du stress cellulaire et de la mort à l’aide de la microscopie confocale laser UV conventionnelle. J. Vis. Exp. (2017) &lt;p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'&gt;Dans cette vidéo, nous explorons la technique de l’ablation au laser UV de haute intensité pour cibler et étudier avec précision les neurones individuels chez le poisson-zèbre transgénique. Nous montrons comment...

Ablation sélective au laser d’un seul neurone chez une larve de poisson-zèbre à l’aide d’un microscope confocal

Source : Muto, A., et al. Ablation d’une population neuronale à l’aide d’un laser à deux photons et son évaluation à l’aide de l’imagerie calcique et de l’enregistrement comportemental chez les larves de poisson-zèbre. J. vis. exp. (2018) Dans cette vidéo, une procédure d’ablation laser à deux photons est démontrée, permettant la destruction sélective des neurones fluorescents chez les larves de poisson-zèbre immobilisées par l’agarose. L’imagerie à haute résolution avant et après...

Ablation neuronale ciblée par microscopie à deux photons dans un larava de poisson-zèbre

Nous présentons ici un protocole pour l’ablation d’une sous-population génétiquement marquée de neurones par un laser à deux photons de larves de poisson zèbre.

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

Le développement embryonnaire nécessite une coordination à grande échelle du mouvement cellulaire. L’ablation laser médiée par l’excitation à deux photons permet l’ablation en 3 dimensions contrôlée spatialement de grands groupes de cellules profondes. De plus, cette technique permet de sonder la réaction des cellules qui migrent collectivement in vivo à des perturbations dans leur environnement mécanique.

Ablations volumiques profondes et spatialement contrôlées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la Gastrula du poisson-zèbre

Nous présentons un protocole pour capturer la dynamique de la régénération de la nageoire caudale des larves de poisson-zèbre à l’échelle de l’ensemble du tissu à l’aide de la stéréomicroscopie basée sur le fond clair. Cette technique permet de capturer la dynamique de régénération avec une résolution de cellule unique. Cette méthodologie peut être adaptée à tout stéréomicroscope équipé d’une caméra CCD et d’un logiciel de time-lapse.

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

Découvrez l'ablation par laser à deux photons d'ostéoblastes chez les larves de Danio rerio pour étudier la régénération osseuse et la réponse immunitaire. Cette méthode permet d'analyser le rôle des macrophages dans la guérison.

Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

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