Name: Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez l'édition génique CRISPR-Cas9 par électroporation dans les cellules THP-1 et l'isolement de clones unicellulaires. Cette méthode permet d'étudier la résistance des macrophages à l'infection par le VIH.

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<ol><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+by+normal+human+monocytes%3A+inter-subject+variation+and+relationship+to+an+IL-1+receptor+antagonist+%28IL-lRa%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism.</a> Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).</li>
<li>Bol, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+variation+in+in+vitro+HIV-1+susceptibility+of+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 390 (2), 205-211 (2009).</li>
<li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).</li>
<li>O'Neill, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+bulk+RNA-sequencing+reveal+differences+in+monocyte+susceptibility+to+Influenza+A+virus+infection+between+Africans+and+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans.</a> Front Immunol. 12, 768189(2021).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparability+study+of+monocyte-derived+dendritic+cells%2C+primary+monocytes%2C+and+THP1+cells+for+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses.</a> J Immunol Methods. 498, 113147(2021).</li>
<li>Inagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-g-induced+apoptosis+and+activation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages.</a> Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).</li>
<li>Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+activities+of+stevioside+and+its+metabolite+steviol+on+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells.</a> J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).</li>
<li>Chanput, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucans+are+involved+in+immune-modulation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages.</a> Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP3+inhibits+type+I+interferon+signaling+by+deubiquitinating+RIG-I-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors.</a> Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+suppresses+innate+immune+responses+to+viral+infections+and+inflammatory+stimuli+by+inhibiting+the+NF-%CE%BAB+and+interferon+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).</li>
<li>Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+anchored+interaction+landscape+of+THP-1+macrophages+captures+early+immune+response+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes.</a> Cell Immunol. 355, 104148(2020).</li>
<li>Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anp+and+BNP+exert+anti-inflammatory+action+via+npr-1%2Fcgmp+axis+by+interfering+with+canonical%2C+non-canonical%2C+and+alternative+routes+of+inflammasome+activation+in+human+THP1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Martinat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+SAMHD1+at+Lysine+595+is+required+for+HIV-1+restriction+in+non-cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).</li>
<li>Rensen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+and+reverse+transcription+of+HIV-1+genomes+in+nuclear+niches+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages.</a> EMBO J. 40 (1), e105247(2021).</li>
<li>Ikeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOBEC3+degradation+is+the+primary+function+of+HIV-1+Vif+determining+virion+infectivity+in+the+myeloid+cell+line+THP-1%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1.</a> mBio. 14 (4), e0078223(2023).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Kurosaki, T., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay+in+humans+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance.</a> J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).</li>
<li>Tuladhar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-based+mutagenesis+frequently+provokes+on-target+mRNA+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation.</a> Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).</li>
<li>Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+factors+that+dictate+if+terminating+ribosomes+cause+or+counteract+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+transfection+efficiency+in+THP-1+suspension+cells+without+PMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment.</a> Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).</li>
<li>Ji, W., Zhang, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+using+lentivirus+to+establish+THP-1+suspension+cell+lines+for+immunostaining+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).</li>
<li>Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. 
 <a target="_blank" href="https://www.synthego.com/help/citing-ice">https://www.synthego.com/help/citing-ice</a> (2019).</li>
<li>Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+protein+coding+region+integrity+in+cDNA+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects.</a> Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).</li>
<li>Pedersen, A. G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+prediction+of+translation+initiation+sites+in+eukaryotes%3A+Perspectives+for+EST+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Int+Conf+Intell+Syst+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis.</a> Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).</li>
<li>Laguette, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+the+dendritic-+and+myeloid-cell-specific+HIV-1+restriction+factor+counteracted+by+Vpx%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx.</a> Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).</li>
<li>Hrecka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+relieves+inhibition+of+HIV-1+infection+of+macrophages+mediated+by+the+SAMHD1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein.</a> Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).</li>
<li>Seki, A., Rutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+RNP+transfection+for+highly+efficient+CRI+SPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.</a> J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mutant+renal+cell+lines+using+CRISPR+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies.</a> Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 888(2018).</li>
<li>Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illegitimate+translation+causes+unexpected+gene+expression+from+on-target+out-of-frame+alleles+created+by+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9.</a> Sci Rep. 6, 39608(2016).</li>
<li>Bowling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+alternate+start+site+allows+N-terminal+nonsense+variants+to+escape+NMD+and+results+in+functional+recovery+by+readthrough+and+modulator+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination.</a> J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).</li>
<li>Inácios, Â, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+mutations+in+close+proximity+to+the+initiation+codon+fail+to+trigger+full+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inversions+and+duplications+of+mammalian+regulatory+DNA+elements+and+gene+clusters+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9.</a> J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162 (4), 900-910 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; m filtre à seringue</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td>_</td></tr><tr><td>0,4 % bleu trypan</td><td>Beckman Coulter</td><td>383200</td><td>_</td></tr><tr><td>1,5 mL tube</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>_</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>_</td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo</td><td>scientific</td><td>R1161</td><td>_</td></tr><tr><td>75 cm&sup2 ; Flacon de culture Capuchon ventilé</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>_</td></tr><tr><td>8 bandes Tubes PCR avec bouchons</td><td>Technologies Life AM12230</td><td></td><td>_</td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits Plaques</td><td>Corning</td><td>à</td> fond plat 353072<td>_</td></tr><tr><td>96 puits Fond rond</td><td>Corning</td><td>353077</td><td>_</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Euromedex</td><td>D5</td><td>_</td></tr><tr><td>ATGpr</td><td>_</td><td>_</td><td>https://atgpr.dbcls.jp/</td></tr> <tr><td>Système d’imagerie ChemiDoc</td><td>BIO-RAD</td><td>12003153</td><td>_</td></tr><tr><td>Comptage de lames</td><td>NanoEntek</td><td>DHC-N04</td><td>_</td></tr><tr><td>CRISPOR_</td><td></td><td>_</td><td>http://crispor.gi.ucsc.edu/</td></tr> <tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>_</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>EMBL-EBI</td><td>_</td><td>https://www.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>Fœtus Bovin Sérum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Life Sciences</td><td>v10.10</td><td>_</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus Échelle d’ADN</td><td>Thermo scientific</td><td>SM0323</td><td>_</td></tr><tr><td>Genome Data Viewer</td><td>NCBI</td><td>_</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/</td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 9.3.1</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymérases</td><td>Agilent</td><td>600679</td><td>_</td></tr><tr><td>ICE Outil d’analyse CRISPR</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis</td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Touch BIO-RAD</td><td>_</td><td>Version 2.4.0.03</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Inclus avec T7EI M0302S</td></tr><tr><td>Neon Kit, 10 &micro ; L</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025K</td><td>Kit d’électroporation contenant des pointes, des tubes, un tampon R et E</td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>_</td></tr><tr><td>NetStart 1.0</td><td>_</td><td>_</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/</td></tr> <tr><td>Synthego</td><td>_</td><td>_</td>PCR <td>sans nucléase</td></tr> <tr><td>(EGFP)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT</td></tr><tr><td>amorce PCR (SAMHD1)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>_</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714</td><td>_</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>_</td></tr><tr><td>PrimerQuest</td><td>IDT</td><td>_</td><td>https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>_</td></tr><tr><td>QuickExtract Solution d’extraction d’ADN</td><td>Biosearch Technologies</td><td>QE09050</td><td>_</td></tr><tr><td>RPMI 1640, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td>_</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 7</td></tr><tr><td>SpCas9 2NLS Nuclease</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>_</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>_</td></tr><tr><td>Synthetic sgRNA (EGFP)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCGCCG</td></tr><tr><td>ARNg synthétique (SAMHD1)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU</td></tr><tr><td>Seringue Plastipak Luer Lock</td><td>BD</td><td>301229</td><td>_</td></tr><tr><td>T100 Thermocycleur</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td>_</td></tr><tr><td>T7 endonucléase I</td><td>Nouveau Angleterre Biolabs</td><td>M0302S</td><td>_</td></tr><tr><td>TAE tampon UltraPure, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15558026</td><td>400 mM Tris-Acétate, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>THP-1 cellules</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td>_</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>_</td></tr><tr><td>ZE5 Analyseur de cellules</td><td>BIO-RAD</td><td>12014135</td><td>_</td></tr></tbody></table>

inactivation du gène crispr-cas9 médiée par électroporation dans les cellules thp-1 et isolement de clones unicellulaires

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

Une lignée cellulaire THP-1 a été générée exprimant de manière stable la protéine rapporteure GFP (THP-1_GFP) (Figure 2A) et utilisée comme outil pour établir un protocole pour une édition efficace du gène médiée par CRISPR-Cas9. Dans ce but, 3 sgRNA ciblant le gène EGFP ont été conçus avec l’outil webCRISPOR 29 (Figure 2B), qui ont été simultanément complexés avec Cas9 à un rapport molaire de 9:1 pour former des RNP avant d’être...

Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

electroporation-based-crispr-cas9-mediated-gene-knockout-thp-1-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Dans cette vidéo, nous démontrons l’édition du génome tout-en-un basée sur CRISPR-Cas9 dans des cellules en culture où Cas9 et l’ARNsg sont fournis en tant que construction plasmidique unique aux cellules. Le système CRISPR-Cas9 et le gène souhaité à insérer ont été introduits dans les cellules par technique d’électroporation pour faciliter l’édition de gènes.

Édition du génome CRISPR tout-en-un : une méthode d’inhibition de gènes basée sur la réparation dirigée par homologie dans des cellules cultivées à l’aide du système CRISPR-Cas9

Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer l’édition de gènes dans des cellules T humaines à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un mélange de lymphocytes T CD4+ et CD8+ primaires est associé à un complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9, ciblant des gènes spécifiques pour l’inactivation. Lors de l’électroporation, l’ARNsg guide Cas9 vers la séquence d’ADN cible, créant ainsi des coupes précises. Ces coupures sont ensuite réparées par le mécanisme d'assemblage non homologue de la...

Une technique CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes dans les lymphocytes T

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Nous présentons ici un protocole visant à modifier génétiquement les cellules primaires ou agrandis humaines tueuses naturelles (NK) à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines (Cas9/RNP). En utilisant ce protocole, nous avons généré des cellules NK humaines déficients pour transformer le récepteur du facteur de croissance – b 2 (TGFBR2) et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

Présenté ici est un protocole pour l'édition efficace de gène de ribonucleoprotein-mediated de CRISPR/Cas9 dans les cellules mammifères utilisant l'électroporation de tube.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

La méthode présentée décrit la génération d’un gène knock-out médié par CRISPR dans la lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), qui exprime de manière stable des sgRNA ciblant le gène L2HGDH à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace.

Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

Ici, nous décrivons un protocole complet pour générer et utiliser des organoïdes de glioblastome modifiés en laboratoire (LEGO) pour étudier les dépendances génotype-phénotype et cribler des médicaments potentiels pour le traitement du glioblastome.

Culture organoïde de glioblastome conçue en laboratoire et criblage de médicaments

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Découvrez l'édition génique CRISPR-Cas9 par électroporation dans les cellules THP-1 et l'isolement de clones unicellulaires. Cette méthode permet d'étudier la résistance des macrophages à l'infection par le VIH.

Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

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