הערכת התקשרות פנאומוקוקית לתאי אנדותל אנושיים ראשוניים תחת זרימת מדיה קבועה

הנח שקופית תעלה מצופה ג'לטין, המחוברת למשאבה מיקרופלואידית, על במת מיקרוסקופ.

השקופית מכילה תאי אנדותל אנושיים ראשוניים שגודלו תחת מדיה זורמת, עם מחרוזות של פקטור פון וילברנד או VWF, גליקופרוטאין, על פני התא.

מיתרים אלה נוצרים על ידי גירוי התאים בהיסטמין.

זרימת מדיה מבוקרת, המיושמת דרך המשאבה המיקרופלואידית, מקדמת הפרשת VWF ושחרורו. פעולה זו חושפת תחומי איגוד ספציפיים במחרוזות VWF.

עצור את זרימת המדיה, הוסף נוגדן ירוק מצומד פלואורופור ספציפי ל-VWF, והמשך את הזרימה כדי לתייג את המחרוזות עם הנוגדן.

השהה את זרימת המדיה והכנס חיידקי פנאומוקוק אדומים המבטאים חלבון פלואורסצנטי.

הפעל מחדש את הזרימה כדי להפיץ את החיידקים, מה שמאפשר היצמדות לתחומים החשופים באמצעות הידבקויות פני השטח.

באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, דמיין קשירת חיידקים בזמן אמת למיתרים.

עצור את זרימת המדיה ורכוש תמונות Z-stack כדי לכמת את ההתקשרות של חיידקים לתאי האנדותל.

להדמיה מיקרוסקופית, הנח את היחידה הנוזלית בתא החימום של 37 מעלות צלזיוס. הנח את שקופית הערוץ על הבמה של מיקרוסקופ שחומם מראש.

לשלוט במורפולוגיה של התא ובשלמות שכבת ה-HUVEC לפני הזרקת היסטמין וחיידקים למחזור הזרימה. שמור על הגדרת הזרימה. לגרום לשחרור VWF מגופי פאלאדה ברי קיימא אנדותל על ידי הזרקת 136 מיקרוליטר של תמיסת מלאי היסטמין של 100 מילי-מולרית דרך פתח הזרקה למדיום ה-ECGMS המסתובב בצינורות הזילוף.

לזיהוי אימונופלואורסצנטי של מחרוזות VWF מרובות, יש להזריק 20 מיקרוגרם של נוגדן מצומד FITC ספציפי ל-VWF בנפח של 200 מיקרוליטר PBS לתוך 13.6 מיליליטר של מדיום ECGMS במחזור הדם. כדי לכמת את ההתקשרות הפנאומוקוקית למחרוזות ה-VWF שנוצרו על משטחי תאי HUVEC, הזריק 1.35 פעמים 10 ל-CFU השמיני למיליליטר RFP המבטא פנאומוקוק בנפח מקסימלי של מיליליטר אחד למדיום ה-ECGMS באמצעות יציאת ההזרקה. בחר יעד טבילת שמן פי 63 להגדלת מיקרוסקופ והתאם את הגדרות מסנן הקרינה בתוכנת המיקרוסקופ לערוץ RFP עם מסנן זיהוי של 540 ננומטר לזיהוי RFP המבטא פנאומוקוק.

לכימות ההתקשרות של חיידקים למחרוזות VWF, צור תמונות של ערימות Z של לפחות 30 תצוגות שדה מייצגות שכל אחת מהן מכילה כ-10 HUVEC שלמים מבחינה מורפולוגית וספרו את כמות הפנאומוקוק.