סינתזה של אנטיגנים של חלבון ממברנה מיוצב ננו-דיסק באמצעות מערכת נטולת תאים

קח מערכת נטולת תאים חיידקית שחסרה מבנים תאיים שלמים אך שומרת על הרכיבים המולקולריים הדרושים לשעתוק ותרגום במבחנה .

הציגו פלסמידים המקודדים את אנטיגן חלבון הממברנה וחלבון הפיגום, יחד עם פוספוליפידים ופולימרים סינתטיים.

הוסיפו לתערובת ATP, GTP ותערובת חומצות אמינו כדי להתחיל ייצור חלבון.

במקביל, הכינו תמיסת הזנה מועשרת בתערובת חומצות האמינו.

טען את התערובת לתא הפנימי ואת תמיסת ההזנה לתא החיצוני של מכשיר דיאליזה כפול.

במהלך הדגירה, המצעים מתפזרים מהחדר החיצוני לפנימי דרך הממברנה החדירה למחצה, מה שמקל על שעתוק פלסמיד ותרגום חלבונים.

חלבון הפיגום מרכיב את הפוספוליפידים והפולימרים לננו-דיסקים ליפידים ומקל על קיפול ושילוב של MPA במבנים אלה.

תוצרי לוואי הנוצרים במהלך התגובה מתפזרים לתוך החדר החיצוני, ושומרים על תנאים אופטימליים להיווצרות MPA מיוצב ננו-דיסק.

הכן MOMP-tNLPs על ידי שימוש בשיטה נטולת תאים.

הפשירו את מאגר הבנייה מחדש מערכת ביטוי החלבון נטול התאים שעתיים לפני הגדרת התגובה, והוסיפו מעכב פרוטאז נטול EDTA למאגר. השתמש בערכה המיועדת להפעלת חמש תגובות של מיליליטר אחד. עבור כל תגובה של מיליליטר אחד, הוסף 525 מיקרוליטר של מאגר בנייה מחדש לבקבוק הליזאט E.coli וגלגל אותו להמסה.

הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר הבנייה מחדש לבקבוק התגובה המכיל את התוסף והתמוסס על ידי גלגול. לאחר מכן, הוסף 8.1 מיליליטר של מאגר בנייה מחדש לבקבוק הזנת התגובה, וגלגל אותו להמסה. לבקבוק תערובת חומצות אמינו, הוסף שלושה מיליליטר של מאגר בנייה מחדש כדי להמיס אותו.

לבקבוק אחר של מתיונין, הוסיפו 1.8 מיליליטר של מאגר בנייה מחדש, המיסו אותו ואחסנו אותו על קרח. הוסף 225 מיקרוליטר מהתערובת המשוחזרת, 270 מיקרוליטר מתערובת חומצות האמינו המשוחזרת ללא מתיונין, ו-30 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר לבקבוק הליזאט E.coli . יתר על כן, הוסיפו לתערובת 400 מיקרוליטר מתערובת DMPC/telodendrimer, 15 מיקרוגרם של פלסמיד MOMP ו-0.6 מיקרוגרם של דלתא-49 ApoA1 וערבבו אותה.

Aliquot 20 מיקרוליטר מהתמיסה הכוללת בצינור של 1.5 מיליליטר לתגובת בקרה המבטאת GFP. הכן תמיסת הזנה על ידי הוספת 2.65 מיליליטר מתערובת חומצות האמינו המשוחזרת ללא מתיונין ו -300 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר. העבירו מיליליטר אחד מתמיסת התגובה לתא התגובה הפנימי בערכת התגובה נטולת התאים ואטמו אותה.

מלאו את החדר החיצוני של כלי התגובה ב -10 מיליליטר מתמיסת ההזנה וסגרו אותו. הוסף 0.5 מיקרוליטר של פלסמיד בקרת GFP ל-20 מיקרוליטר של תערובת התגובה. הכניסו את התגובה לשייקר במהירות של 300 סיבובים לדקה למשך 18 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.

עקוב אחר התגובה תחת אור UV לאחר 15 דקות עבור פלואורסצנטיות עקב סינתזת GFP.