אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
Biological Techniques
0 צפיות • 3:43 דק׳ • July 8th, 2025
התחל עם DNA פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי או תרחיף pDNA במדיה. הוסף ננו-חלקיקים מגנטיים מצופים פולימר קטיוני תואמים ביולוגית לתרחיף ה-pDNA והדגירה.
הפולימרים הקטיוניים הטעונים חיובית מקיימים אינטראקציה אלקטרוסטטית ומצומדים עם pDNA טעון שלילי, וכתוצאה מכך עיבוי pDNA ויצירת 'פוליפלקסים מגנטיים' עם מטען חיובי כולל.
כעת, העבירו את תערובת הפוליפלקס לצלחת מרובת בארות המכילה תרבית תאי עצב ראשונית של עכבר. הרכיבו את הצלחת מרובת הבארות על צלחת מגנטית ודגרו.
השדה המגנטי שנוצר על ידי הלוח המגנטי גורם לפוליפלקסים לשקוע ולהצטבר על פני התא העצבי. מגע הדוק זה עם פני התא מקל על קשירה לא ספציפית של פוליפלקסים טעונים חיובית לפרוטאוגליקנים הקשורים לקרום התא טעונים שלילית.
לאחר מכן, הפוליפלקסים מופנמים באמצעות אנדוציטוזיס - תהליך שבו האזורים המקומיים של קרום התא פולשים וצובטים ליצירת שלפוחיות הקשורות לממברנה הנקראות אנדוזומים.
בתוך הציטופלזמה, הפולימרים הקטיוניים של הפוליפלקס גורמים להצטברות פרוטונים באנדוזום. הזרם בו זמנית של יוני כלוריד לשמירה על ניטרליות המטען מגביר את החוזק היוני האנדוזומי, מה שמוביל לזרם מים.
בסופו של דבר, האנדוזומים מתנפחים ונקרעים עקב לחץ אוסמוטי, ומשחררים פוליפלקסים לציטופלזמה. ה-pDNA המעובה בתוך הפוליפלקסים מקל על תנועתיות ציטוזולית מוגברת, בעוד שהפולימרים הקטיוניים מגנים על pDNA מפני פירוק נוקלאז ציטופלזמי.
לאחר דיסוציאציה של הפוליפלקסים, ה- pDNA המשוחרר - בשלב מחזור התא המתאים כאשר הממברנה הגרעינית מתפרקת באופן זמני - מועבר לגרעין. תאים שהועברו בהצלחה עם pDNA מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים.
כדי לתרבית נוירונים מוטוריים, יש לדלל אותם ל -5,000 עד 10,000 תאים ב -500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לבאר בצלחת של 24 בארות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הלמינציה בעזרת קצה פיפטה P1000. העבירו מיד את הנוירונים המוטוריים המדוללים במדיום תרבית ללוחות הציפוי כדי למנוע התייבשות.
להכנת DNA, השעו מחדש 1 מיקרוגרם DNA ב-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית עצבית, ומערבולת למשך 5 שניות. להכנת צינור החרוזים, יש להשעות מחדש 1.5 מיקרוליטר חרוזים ב -50 מיקרוליטר של מדיום תרבית עצבית. הוסף 50 מיקרוליטר תמיסת חרוזים ל -50 מיקרוליטר תמיסת DNA, ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
במהלך דגירה זו, משוך 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית מהבאר שתועבר. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר מתערובת חרוזי ה-DNA לכל באר, ודגרו את צלחת 24 הבארות 20 עד 30 דקות על הלוח המגנטי ב-37 מעלות צלזיוס.