אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
Biological Techniques
0 צפיות • 2:52 דק׳ • July 8th, 2025
מבחני היווצרות מושבות מודדים את יכולת ההתפשטות של התאים לגדול למושבות.
ראשית, תרחיף תאים שמקורו במח עצם זרע המורכב מאריתרוציטים ותאים חד-גרעיניים, כולל תאי גזע מזנכימליים או MSCs, במדיה על צלחת תרבית ודגירה. MSCs, נצמדים לתחתית הצלחת בעוד אריתרוציטים ותאים חד-גרעיניים נשארים בתרחיף ומושלכים לפח.
הוסף מדיה חדשה המכילה גורמי גדילה כדי לתמוך בהישרדות MSC. בהתאם לפוטנציאל ההתפשטות האישי שלהם, MSCs משתכפלים ליצירת מושבות.
לאחר מכן, טפלו במושבות במתנול. מתנול מחלחל לתאים, מעביר מים מהסביבה התוך-תאית ומפרק חלבונים, ושומר על הארכיטקטורה התאית.
דגרו את המושבות הקבועות בתמיסת צביעה של Giemsa - תערובת של תוצרי חמצון של מתילן כחול, בעיקר תכלת B, צבע בסיסי, ואאוזין Y, צבע חומצי. עם הדיפוזיה לתאים, דימרים תכלת B טעונים חיובית נקשרים באמצעות אינטרקלציה ל-DNA טעון שלילי בגרעין, ומעניקים כתם כחול.
מונומרים של אאוזין Y טעונים שלילית מקיימים אינטראקציה עם מטענים חיוביים לא מנוטרלים על דימרים B תכולים קשורים, ויוצרים 'קומפלקס אאוזין-Y-תכלת-B', ומשנה את צבעו של ה-DNA המוכתם בכחול לסגול.
בציטופלזמה העשירה בריבוזום, תכלת B נקשר ל-RNA טעון שלילית, אך חדירה מופחתת של אאוזין Y לריבוזומים צפופים מאוד, מונעת היווצרות קומפלקס אאוזין-Y-תכלת-B, ומכתים את RNA בכחול.
כעת, שטפו את הצלחת עם מאגר כדי להסיר עודפי כתמים ולייבש באוויר. ספרו את מספר המושבות, המופיעות כאשכולות של תאים עם גרעינים סגולים וציטופלזמה כחולה.
כדי לבצע את בדיקת ה-CFU, הכינו 10 מיליליטר של תמיסת Giemsa למנה, על ידי שימוש במים סטריליים כדי לדלל את תמיסת המלאי 1 עד 10. הסר את המדיום מכלי תרבית התאים, והשתמש ב- PBS כדי לשטוף בזהירות את התאים.
עם מתנול טהור, מקבעים את התאים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ואז זורקים את המתנול ומוסיפים את תמיסת Giemsa. דגירה בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, יבש את ראש הצלחת באוויר תחילה על מגבת נייר. עם טוש בגב הצלחת, ספרו ידנית את המושבות.