בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים לאימות מצומדים כימית של נוגדן-אנטיגן מצומדים כימית

כדי לעורר תגובה חיסונית, אנטיגנים נקשרים לנוגדנים הספציפיים לקולטנים האנדוציטים הנמצאים על פני התאים הדנדריטים, או DCs - התאים המציגים אנטיגן - המסייעים בספיגת אנטיגנים.

היווצרות קומפלקס נוגדנים-אנטיגן היא צעד מכריע וניתן להשיג אותה במבחנה על ידי צימוד כימי של האנטיגן לנוגדנים חד-שבטיים המכוונים DC.

כדי לאמת את יעילות תהליך ההצמדה, התחל עם לוחית ELISA מצופה מראש בנוגדנים שנלכדו. טפל בצלחת בתמיסה חוסמת כדי למנוע קשירה לא ספציפית של האנטיגנים למשטח המצופה.

הוסף לצלחת צימודים של נוגדנים-אנטיגנים מקושרים כימית, ודגירה. האפיטופ הספציפי של האנטיגן מקיים אינטראקציה עם הפרטופ של הנוגדן שנלכד ויוצר קומפלקס נוגדן-אנטיגן-נוגדן.

לאחר מכן, כסו את הצלחת בקבוצה שלישית של נוגדנים המקושרים לאנזים. נוגדנים אלה נקשרים במיוחד לנוגדנים הראשוניים הקיימים במצומד ומאפשרים את גילויו.

הוסף מאגר המכיל את המצע הכרומוגני כדי לדמיין את המצומדים. האנזים המחובר לנוגדנים מגיב עם המצע ויוצר את המוצר הצבעוני.

טפל בצלחת בתמיסת אינאקטיבציה מחומצת, המשביתה את האנזים ומסיימת את התגובה. נתח את הצלחת באופן ספקטרופוטומטרי. נוכחות של תמיסה צבעונית מאמתת את נוכחותם של צימודי נוגדנים-אנטיגן ומאשרת צימוד מוצלח.

כדי לאמת את הצלחת ההצמדה על ידי ELISA, יש לצפות צלחת ELISA מתאימה של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-OVA לבאר, ולדלל באופן סדרתי anti-DEC-205/OVA ביחס של 1:2 במאגר חוסם, כדי לקבל דילולים מ-6 מיקרוגרם למיליליטר ל-93.8 ננוגרם למיליליטר.

הוסף 100 מיקרוליטר מכל דילול לבארות המתאימות של הצלחת המצופה נוגדנים לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה יש להוסיף לצלחת 100 מיקרוליטר של נוגדן מצומד חזרת פרוקסידאז כנגד המצומד נגד DEC-205/OVA לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מצע פרוקסידאז חזרת לכל באר, כדי לאפשר ניתוח של תגובת הצבע על ידי ספקטרופוטומטריה.