שיטת מבחנה ליצירת אורגנואידים אנושיים במוח

התחל בתרבית של נוירוספרות, אשכולות צפים חופשיים של תאי אב נוירו-אפיתליים.

העבירו את הנוירוספרות הללו ליריעת הטבעה.

הסר מדיה. הוסף טיפה של מטריצת ממברנה חוץ-תאית המכילה חלבונים וגורמי גדילה לכל נוירוספרה.

דגירה כדי שהמטריצה תתמצק, והטמיעה בתוכה את הנוירוספרות.

כעת, העבירו את הנוירוספרות המוטמעות במטריקס באמצעות מדיה נוירוספירית ללוח תרבית המכיל מדיה נוירוספרית.

דגירה. מטריצת הממברנה החוץ-תאית ומרכיביה מקלים על התמיינות תאי אב נוירו-אפיתל לתאים נוירו-אפיתליים המתרבים ויוצרים לומן מלא בנוזל.

לאחר הדגירה, העבירו נוירוספרות לבקבוק ספינר המכיל מדיה אורגנואידית מוחית מחוממת מראש. דגירה תוך ערבוב לשיפור דיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים, המקדמת צמיחה תאית.

גורמי גדילה ומעכבי מולקולות קטנות במדיה מקדמים התמיינות עצבית ומתפתחים לתאים של אזורים ספציפיים במוח, ויוצרים אורגנואידים במוח בוגרים.

כדי להתחיל בהליך זה, אסוף את הנוירוספרות בעזרת מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר, בעזרת קצה של 2 מילימטר שנחתך בעבר במספריים סטריליים. לאחר מכן, הניחו את הנוירוספרות במרחק של כ -5 מילימטרים זו מזו על סרט פרפין בצלחת של 100 מילימטר, והסירו בזהירות כמה שיותר מהמדיום שנותר. לאחר מכן, הוסף טיפה של מטריצת EHS על כל נוירוספירה בודדת.

דגירה של טיפות מטריצת EHS עם הנוירוספרות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הנוירוספרות בזהירות מסרט הפרפין על ידי שטיפתם במדיום נוירוספרה. לאחר מכן, דגרו על הנוירוספרות בארבעת הימים הבאים, והוסיפו 2 מיליליטר של מדיום נוירוספרה טרי ביום השני.

בהליך זה, הוסף 100 מיליליטר של מדיום אורגנואיד מוחי לכל בקבוק ספינר דרך זרועותיו הצדדיות וחמם מראש את המדיום בחממה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן ודא שכל הנוירוספרות מופרדות. אם שניים או יותר מחוברים דרך מטריצת EHS, הפרד ביניהם על ידי חיתוך מטריצת החיבור בעזרת אזמל.

הגדר תוכנית ערבוב ב -25 סל"ד. העבירו בזהירות את הנוירוספרות המוטבעות במטריצת EHS לתוך צלוחיות הספינר המכילות 100 מיליליטר של מדיום אורגנואיד. לאחר מכן, הנח את צלוחיות הספינר על משטח ערבוב מגנטי בחממה למשך 14 יום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. זהו יום האפס של תרבות האורגנואידים. החלף את המדיום פעם בשבוע על ידי הסרת מחצית מהמדיום והוספת אותה כמות של מדיום טרי.