טכניקה לדגירת רקמה עצבית ממושכת של הרשתית

קח עין עכבר שלמה בנוזל מוחי מלאכותי, או aCSF, וחתך כדי לבודד את העין המכילה את הרשתית.

טפל בתמיסה אנזימטית להסרת הממברנה המגבילה הפנימית, וחשיפת תאי העצב

.

טבלו את הרקמה בתמיסת עיכוב כדי לעצור את העיכול, ושטפו כדי להסיר עודפי תמיסה.

הניחו את הרקמה בחממה מיוחדת בטמפרטורה נמוכה כדי להאט את חילוף החומרים התאי, תוך שמירה על הרקמה.

חממה זו כוללת תא ראשי עם רשת להרכבת רקמות. החדר מלא ב-aCSF, והטמפרטורה וה-pH שלו נשלטים כדי לשמר את פונקציונליות הרקמות.

כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי, ה-aCSF נשאב לתוך תא אחר ומטופל בקרינה אולטרה סגולה כדי להרוג כל חיידק.

לאחר מכן נשאב ה-aCSF המעוקר בחזרה לתא הראשי.

כדי לבודד את הרשתית, הסר את העין, הפרד את הרשתית מהרקמה שמסביב והחזיר אותה לאינקובטור.

להכנת תושבת שלמה ברשתית, יש להוציא מיד את העיניים מבעל חיים שעבר המתת חסד. בצע חתך קטן לאורך ה-ora serrata, והנח את העיניים ב-Ames Media או ב-aCSF עם אספקת קרבוגן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר מיד את הקרנית, העדשה והזגוגית על ידי חיתוך לאורך האורה-סרטה במספריים קטנים, והסר אותם בעזרת מלקחיים. מניחים את הרקמה במערכת הדגירה בטמפרטורת החדר.

כדי להסיר את הממברנה המגבילה הפנימית, העבירו את גביעונית העין המכילה את הרשתית לצנצנת זכוכית קטנה המכילה פפאין, L-ציסטאין, EDTA ו-DNAse בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מרחו קרבוגן על התמיסה דרך המכסה, אך אל תבעבעו. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הנחת הרקמה בתמיסת אובומוקואיד ו-BSA למשך 10 דקות ב-BSS של ארל. לאחר מכן, שטפו את הטישו היטב עם aCSF.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה למערכת הדגירה והפחיתו את הטמפרטורה לכ-15 עד 16 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את רקמת הרשתית למיקרוסקופ; בודדו את הרשתית מכוס העין, וחתכו אותה לארבע חתיכות בעזרת סכין גילוח. אם הרשתית כולה נדרשת, בצע ארבעה חתכים קטנים בהיקף הרשתית כדי לאפשר לה לשכב שטוחה.

כעת ניתן להעביר את הרקמה הזו למיקרוסקופ לאלקטרופיזיולוגיה, או לשמור אותה בחממת המוח. הרקמה נשמרת בתא הראשי המכיל את הבדיקות למדידות pH וטמפרטורה. תא שני מבודד מהתא הראשי ונחשף לאור UVC של 1.1 וואט על מנת להקרין חיידקים הצפים בתמיסה. השתמש במשאבה פריסטלטית כדי להזרים aCSF דרך שני התאים, ובצלחת קרה תרמו-אלקטרית של פלטייר כדי לקרר או לחמם את החדר הראשי.