יצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים של עכבר בשיטת הטיפה התלויה

קח תרחיף תאי גזע עובריים של עכבר.

צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים בתווך התמיינות עצבית.

הניחו טיפות של המתלה בצד הפנימי של מכסה צלחת תרבות.

הוסף חיץ לצלחת התחתונה כדי למנוע את התייבשות הטיפות. מניחים את המכסה על הצלחת התחתונה, יוצרים תרבית טיפה תלויה ודוגרים.

בשל כוח הכבידה, התאים מתקבצים ויוצרים אגרגטים תלת מימדיים הנקראים גופים עובריים או EBs.

מניחים את הטיפות בצלחת המכילה את מדיום ההתמיינות ודוגרים תחת תסיסה לצמיחת EBs.

צנטריפוגה והסרה של המדיום; השעו מחדש את ה-EBs במדיום ההתמיינות בתוספת חומצה רטינואית, העבירו אותם לצלחת תרבית ודגרו.

חומצה רטינואית נכנסת לתאים ומעוררת היווצרות קומפלקס שעתוק. הקומפלקס גורם לביטוי גנים, ומפעיל את ההתמיינות לתאי אב עצביים.

ה-EBs המובחנים מוכנים ליישומים במורד הזרם.

התחל בהגדרת תרבית תאי הטיפה התלויה. עבור צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים, התאם את הריכוז ל-500 תאים לכל 20 מיקרוליטר של מדיום התמיינות. הכן מספיק מתלה תאים ל -50 טיפות של 20 מיקרוליטר. השתמש במיקרופיפטה או בפיפטה משחזרת כדי להניח טיפות של 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים על המכסה של צלחת תרבית רקמה, וודא שהטיפות אינן קרובות מדי זו לזו כדי למנוע מהן להתמזג.

מלאו את הצלחת ב -5 עד 10 מיליליטר PBS, והחזירו בזהירות את המכסה לצלחת. דגרו את התרבות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר יומיים, אספו את הטיפות מהמכסה, והניחו אותן בצלחת מתלה תרבית תאים בגודל 10 סנטימטרים, מלאה ב -10 מיליליטר של מדיום התמיינות. לאחר מכן, הנח את הצלחת על שייקר מסלולי המוגדר למהירות נמוכה בחממה. לאחר יומיים נוספים, צנטריפוגה את התאים ב -200 פעמים גרם למשך שלוש דקות, והסר את הסופרנטנט.

כדי לגרום להתמיינות גוף עוברי לתאי אב עצביים, השעו מחדש את התאים במדיום התמיינות עם חומצה רטינואית 5-מיקרומולרית דגרו על הצלחת למשך יומיים. לאחר מכן, החלף את המחצית הקטנה ביותר של המדיום במדיום טרי על ידי הטיית הצלחת והוצאתו החוצה.