אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
Neuroscience
0 צפיות • 3:29 דק׳ • July 8th, 2025
התחל עם iPSCs אנושיים מהונדסים המכילים התמיינות מיובלסט או קידוד חלבון MYOD, גן המושרה על ידי דוקסיציקלין במדיום תאי גזע המכיל מעכבי רו-קינאז.
העבירו את התאים לצלחות מצופות ECM ודגרו כדי לקדם את החיבור לתאים.
בינתיים, המעכב מנטרל אנזימי רו-קינאז תוך-תאיים, ומשפר את כדאיות התאים.
החלף את המדיום במדיום תאי גזע המכיל דוקסיציקלין.
דוקסיציקלין נכנס לתאים ונקשר לחלבונים מפעילים. קומפלקסים אלה נקשרים למקדם, גורמים לביטוי הגנים בתאים מסוימים ומייצרים חלבוני MYOD, המעוררים התמיינות של תאי גזע לתאי שריר.
טפל בתאים במדיום התמיינות מיוגני המכיל גורמי התמיינות מיוגניים כדי לקדם את היווצרותם של צינורות, תא שריר רב-גרעיני.
מאוחר יותר, הציגו מדיום אינדוקציה עצבית עם גורמי גדילה עצביים.
גורמים אלה מבדילים את ה-iPSCs הנותרים לנוירונים מוטוריים ולתאי שוואן היוצרים מעטפת מיאלין סביב הנוירונים.
לבסוף, החלף את המדיום במדיום צומת עצבי-שרירי כדי לקדם קשרים בין הנוירון המוטורי לשריר השריר, ויוצר צמתים עצביים-שריריים.
שטפו את התאים עם 3 מיליליטר PBS לפני הוספת 1 מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים לצלחת פטרי. לאחר 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסף 3 מיליליטר של מדיום תאי גזע עובריים של פרימטים לכל באר, ופיפטה בעדינות שלוש פעמים כדי לנתק את התאים מהכיסוי.
לאחר מכן, אחסנו את תאי הגזע המנותקים המכילים סופרנטנטים לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר לצנטריפוגה, והשעו מחדש את גלולת תאי הגזע ב-3 מיליליטר של מדיום תאי גזע עובריים טריים של פרימטים בתוספת 10 מעכבי מיקרו-מולרי Y27632 ROCK לספירה.
לאחר מכן, יש לדלל את התאים ל-2 x 105 תאים למיליליטר של מדיום, בתוספת ריכוז מעכב ROCK, ולהחזיר 2 מיליליטר תאים לכל כיסוי בכל באר של צלחת 6 הבארות המצופה מטריצה חוץ-תאית.
לאחר 24 שעות, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב -2 מיליליטר של מדיום תאי גזע עובריים טריים של פרימטים בתוספת 1 מיקרוגרם למיליליטר דוקסיציקלין, והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 24 שעות.
בתום הדגירה, החלף את הסופרנטנטים ב -2 מיליליטר של מדיום התמיינות בתוספת דוקסיציקלין לבאר, והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 10 ימים.
בתום הדגירה, החלף את הסופרנטנטים ב -2 מיליליטר של מדיום התמיינות מיוגני בתוספת דוקסיציקלין לבאר, והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 10 ימים נוספים. בתום הדגירה, החלף את הסופרנטנטים ב -2 מיליליטר של מדיום צומת עצבי-שרירי לכל באר, והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 30 יום.