אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
Neuroscience
0 צפיות • 3:29 דק׳ • July 8th, 2025
קחו לדוגמה מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, או iPSC, שגודלו על צלחת מצופה מטריצה חוץ-תאית.
ה-iPSCs מהונדסים גנטית כדי לבטא גורמי שעתוק הגורמים להתמיינות נוירונים מוטוריים.
הסר את המדיה והוסף אנזימים לניתוק המושבות.
לפרק מכנית את התאים לתרחיף חד-תאי ולאסוף אותם.
צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.
השעו מחדש את התאים במדיה המכילה מעכב המונע אפופטוזיס תאי.
צלחת את התאים על צלחת מצופה מטריצה.
הוסף אמצעי התמיינות טריים המכילים את האנטיביוטיקה דוקסיציקלין ומעכבי מולקולות קטנות.
דוקסיציקלין גורם לביטוי גורמי שעתוק, בעוד שהמעכבים חוסמים מסלולי איתות ספציפיים, ומקדמים התמיינות iPSC לאבות הנוירונים המוטוריים.
הוסף אנזימים כדי לנתק את התאים.
אסוף את התאים ונתק אותם מכנית.
צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט. להשעות מחדש את התאים במדיה עצבית.
צלח את התאים על מיקרו-שקופיות מצופות חלבון הדבקה כדי לקדם את היצמדות התאים.
גורמי גדילה במדיה גורמים להבשלת אב לנוירונים מוטוריים.
עבור התמיינות נוירונים מוטוריים, נתק את תרביות התאים שעברו טרנספטציה יציבה עם מגיב דיסוציאציה כפי שהודגם כדי לאפשר לאסוף את התאים בצינור של 15 מיליליטר המכיל 5 נפחים של מדיום DMEM/F12. לאחר צנטריפוגה, יש להשעות מחדש את התאים במדיום iPSC אנושי בתוספת מעכב ROCK מיקרומולרי לספירה.
זרע את התאים על כלים מצופים מטריצה בצפיפות של 6.25 x 104 תאים לסנטימטר מרובע. במשך היומיים הבאים, החלף את הסופרנטנטים במדיום התמיינות טרי בתוספת דוקסיציקלין.
ביום השני, שנה את המדיום למדיום B27 נוירו-בסיסי בתוספת מעכב גמא-סקרטאז, מעכב קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם ודוקסיציקלין. ביום החמישי, נתק את התאים כפי שהודגם, והשהה מחדש את התאים המנותקים ב-4 מיליליטר של מדיום DMEM/F12 לספירה.
פיפטינג חשוב לדיסוציאציה מוחלטת של התאים.
הקפיאו כמות של אבות הנוירונים המוטוריים במדיום הקפאת התאים בהתאם להוראות היצרן, ואספו את שאר התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בתווך עצבי בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולרי.
זרע את התאים על תומכי מיקרו-שקופיות מצופים פולי-אורניתין עם כיסוי פולימרי בצפיפות של 1 x 105 תאים לסנטימטר מרובע. ביום השישי, החלף בזהירות את המדיום במדיום עצבי טרי ללא מעכב לתרבית עד לניתוח במורד הזרם מבלי לנתק את התאים ממשטח התמיכה.