פוטו-טימולציה והקלטות מהדק טלאי של תא שלם של תאי עצב בפרוסות היפוקמפוס עכבר

קח פרוסת מוח של עכבר משותק בתא הקלטה אלקטרופיזיולוגי עם aCSF מחומצן.

פרוסה זו מכילה את מסופי האקסון של נוירונים תלמיים המבטאים תעלות יונים רגישות לאור המאוחות לחלבון פלואורסצנטי.

דמיין את האקסונים של הנוירונים התלמיים הפלואורסצנטיים ובחר נוירון פירמידלי.

קדם פיפטה הקלטה המכילה אלקטרודה בתמיסה תוך-תאית לעבר הנוירון הנבחר בלחץ חיובי קל.

הלחץ החיובי יוצר גומה על הממברנה העצבית במגע.

שחרר את הלחץ ליצירת חותם בעל עמידות גבוהה.

הגדר את פוטנציאל הממברנה לערך שלילי קבוע.

הפעל דופק לחץ שלילי כדי לקרוע את הממברנה, ולהשיג תצורה של תא שלם.

להאיר את מסופי האקסון, להפעיל את התעלות הרגישות לאור ולבצע דה-פולריזציה של הממברנות העצביות, תוך הפעלת פוטנציאל פעולה.

נוירוטרנסמיטורים מעוררים משתחררים, נקשרים לקולטנים על הנוירון המוקלט, וגורמים לזרם קטיונים.

רשום את הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים שנוצרו, מה שמעיד על קשר סינפטי ישיר בין הנוירונים.

כדי לבצע הקלטת מהדק תיקון של תא שלם, העבירו בעדינות פרוסת מוח המכילה את קומפלקס ההיפוקמפוס לתא ההקלטה. החדרה רציפה של תא ההקלטה עם 34 מעלות צלזיוס ACSF מבעבע בקרבוגן במהירות של 2 עד 3 מיליליטר לדקה. בחן בקצרה את ביטוי chronos GFP במסופי אקסון באזור העניין עם תאורת LED כחולה בהגדלה פי 4.

שנה למטרת טבילה של 63x והתאם את המיקוד. בדוק אם יש אקסונים המבטאים Chronos GFP ובחר נוירון פירמידלי להקלטת טלאי. לאחר מכן, מלאו פיפטה בתמיסה פנימית על בסיס אשלגן גלוקונאט. הרכיבו אותו במחזיק הפיפטה על הבמה הראשית. תיקון התא בתצורת מהדק מתח.

התקרב לנוירון המזוהה ולחץ בעדינות את קצה הפיפטה על הסומה. הלחץ החיובי אמור לייצר גומה על פני הממברנה. לאחר מכן, שחרר את הלחץ ליצירת חותם ג'יגה אוהם. לאחר האיטום, הגדר את מתח ההחזקה למינוס 65 מילי-וולט.

שוברים את הממברנה בדופק חד של לחץ שלילי. רשום בתגובות פוסט-סינפטיות מהדק זרם או מתח לגירוי שדה שלם של 475 ננומטר LED של סיבים אפרנטיים המבטאים כרונו. לעורר עם רכבות של 10 גירויים של 2 אלפיות השנייה ב-20 הרץ.